基于天然及重组乳糜微粒模型的亲脂性药物口服经淋巴吸收的机制研究

论文摘要

经淋巴通路是脂溶性药物口服吸收的重要途径之一,有关口服经淋巴吸收的机制研究表明脂溶性药物与乳糜在肠上皮细胞内结合是药物经淋巴转运的关键过程。采用体外天然乳糜结合模型可以很好地预测药物的经淋巴吸收趋势。然而,该模型尚有许多有待改进的地方,主要包括纳入的模型药物数量有限,并且用于分析的理化参数也涵盖得不够,导致对结果的分析有局限性。本文以大鼠天然乳糜微粒为模型,扩大模型药物的数量,增加待考察的理化参数的数量,以建立药物理化性质与乳糜结合率之间的关系。在此基础上,建立种重组乳糜模型,进行药物结合率考察,通过与天然乳糜结合率的相关分析,对其作为天然乳糜替代品的可行性进行评价。本文采用超速密度梯度离心法来分离大鼠血浆中的乳糜微粒,并对其粒径、形态、电泳行为、甘油三酯含量等进行了表征。以粒径、甘油三酯浓度为指标进行了稳定性考察。结果表明,乳糜微粒的粒径范围介于50-350nm,其形态呈圆整的球形。琼脂糖电泳实验结果表明,乳糜微粒停留在原点,而其他作为参照的脂蛋白均发生了不同程度的迁移。天然乳糜微粒中,甘油三酯浓度约4.85±0.26mmol/1,胆固醇浓度约0.544±0.0081mmol/l。制得的乳糜微粒在-20℃条件下能维持稳定约2个月。建立了二十余种模型药物与乳糜微粒结合率的分析测定方法。方法学研究结果表明线性、回收率、精密度等学符合生物样品的分析要求测定了模型药物在长链甘油三酯中的溶解度（SLCT）,并通过查阅SciFinder Scholar2007而整理出可能对药物与乳糜微粒结合率有影响的理化参数12个分别为氢键供体数、氢键受体数、自由旋转键、logD、logP、pKa、分了体积、分子量、熔点、极性表面积、药物地长链油三酯中的溶解度以及密度。使用SAS8.1软件中的偏最小二乘回归法对建立的天然乳糜微粒模型进行分析。以这12个理化参数为自变量,药物-乳糜微粒结合率为因变量,进行了数据分析和拟合。结果表明SLCT、logP、logD是最重要的起正相关作用的因素。药物与天然乳糜微粒的结合是一个复杂的过程,无法仅用一两个理化参数就达到准确地描述的目的,需要同时考虑多个参数的共同作用。用PLS回归分析建立了药物与乳糜微粒结合的数学关系式。将根据该数学模型的预测值对实测值进行线性回归,回归系数值达到0.9813,说明二者间具有良好的相关性,表明实验建立的天然乳糜微粒结合模型可以用于预测未知化合物与乳糜微粒的结合情况,进而推测未知化合物的淋巴转运潜力。由于提取乳糜微粒需要牺牲大量的动物,且动物间存在批间差异,会影响乳糜微粒结合实验的结果。为了寻找此模型的代替品,以橄榄油、1-α-磷酸卵磷脂、溶血卵磷脂、胆固醇甾酯及胆固醇为材料,用薄膜分散法制备了模拟乳糜微粒的乳剂——重组乳糜微粒。以粒径、透射电镜、甘油三酯含量检测等方法对制备的重组乳糜微粒进行了表征。以粒径、甘油三酯含量为指标对其进行了稳定性考察。结果表明,重组乳糜微粒平均粒径约226.3nm,甘油三酯浓度约5.95±0.14mmol/l.胆固醇浓度约0.77±0.06mmol/l.在理化性质上与天然乳糜微粒比较接近。稳定性实验中,重组乳糜微粒在-20℃条件下能维持稳定约15天。测定了模型药物与rCM的结合率,在此基础上对天然和重组乳糜微粒结合模型的相关性进行了考察,发现二者的相关性良好,表明制备的重组乳糜微粒能够较好地取代由大鼠血浆中提取的乳糜微粒。由于重组乳糜微粒所需的材料易得,生物相容性好,制备工艺简便,所需设备也并不复杂,能够节约大量时间及实验资源,同时避免了动物模型的个体差异。作为一种新型的淋巴吸收研究模型,有着潜在的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 基于天然乳糜微粒模型的口服经淋巴吸收的机制研究
• 1. 试剂、仪器及动物
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2. 实验方法
• 2.1 天然乳糜微粒悬液的制备
• 2.1.1 密度梯度溶液的配制
• 2.1.2 天然乳糜微粒的分离方法和流程
• 2.1.3 乳糜微粒悬液的配制
• 2.2 天然乳糜微粒的表征
• 2.2.1 粒径
• 2.2.2 电泳行为
• 2.2.3 甘油三酯及胆固醇浓度测定
• 2.2.4 透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）
• 2.2.5 稳定性
• 2.2.5.1 甘油三酯浓度
• 2.2.5.2 粒径
• 2.2.5.3 丙二醇对结合率测定的影响
• 2.3 模型药物理化参数的获得
• 2.3.1 基本理化参数
• LCT测定'>2.3.2 药物的S_LCT测定
• 2.3.2.1 溶解度测定HPLC方法的建立与评价
• 2.3.2.1.1 色谱条件
• 2.3.2.1.2 标准曲线
• 2.3.2.1.3 准确度
• 2.3.2.1.4 精密度
• 2.3.2.2 模型药物在长链甘油三酯（LCT）中的溶解度
• 2.4 模型药物的含量测定方法
• 2.4.1 乳糜微粒样品预处理方法
• 2.4.2 色谱条件
• 2.4.3 乳糜微粒样品标准曲线的建立
• 2.4.4 乳糜微粒样品分析方法的评价
• 2.4.4.1 方法精密度
• 2.4.4.2 方法回收率
• 2.5 模型药物与天然乳糜微粒的结合
• 2.6 药物-天然乳糜微粒结合率与药物理化参数之间数学关系模型的建立
• 2.7 天然乳糜结合模型预测能力的评价
• 3. 结果与讨论
• 3.1 天然乳糜微粒的表征
• 3.1.1 粒径
• 3.1.2 电泳行为
• 3.1.3 甘油三酯及胆固醇浓度
• 3.1.4 透射电镜
• 3.1.5 稳定性考察
• 3.1.5.1 甘油三酯浓度
• 3.1.5.2 粒径
• 3.1.5.3 丙二醇对结合率测定的影响
• 3.2 模型药物理化参数的获得
• 3.2.1 基本理化参数
• 3.2.2 药物在TG中的溶解度测定
• LCT测定方法的验证'>3.2.2.1 模型药物S_LCT测定方法的验证
• LCT'>3.2.3 模型药物的S_LCT
• 3.3 模型药物含量测定方法的建立与评价
• 3.3.1 方法专属性
• 3.3.2 标准曲线及线性范围
• 3.3.3 方法精密度
• 3.3.4 方法回收率
• 3.4 模型药物与乳糜微粒的结合
• 3.5 药物-乳糜微粒结合率与药物理化参数之间数学关系模型的建立
• 3.6 天然乳糜微粒模型预测能力的评价
• 4. 小结
• 第二部分 重组乳糜微粒（rCM）模型的建立及其在口服经淋巴吸收机制研究方面的应用
• 1. 试剂与仪器
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 rCM的制备
• 2.2 rCM的表征
• 2.2.1 粒径
• 2.2.2 廿油三酯及胆固醇浓度
• 2.2.3 稳定性
• 2.2.3.1 粒径
• 2.2.3.2 甘油三酯浓度
• 2.2.4 透射电镜
• 2.3 模型药物的含量测定方法
• 2.3.1 rCM样品的预处理方法
• 2.3.2 色谱条件
• 2.3.3 标准曲线的建立
• 2.3.4 rCM分析方法的评价
• 2.3.4.1 方法精密度
• 2.3.4.2 方法回收率
• 2.4 模型药物与rCM的结合
• 2.5 rCM与天然乳糜微粒的相关性分析
• 2.6 基于rCM的药物-rCM结合率与药物理化参数数学关系模型的建立
• 2.7 rCM结合模型预测能力的评价
• 3. 实验结果
• 3.1 rCM的表征
• 3.1.1 粒径
• 3.1.2 甘油三酯及胆固醇浓度
• 3.1.3 稳定性
• 3.1.3.1 甘油三酯浓度
• 3.1.3.2 粒径
• 3.1.4 透射电镜
• 3.2 模型药物含量测定方法的建立与评价
• 3.2.1 rCM样品的预处理方法
• 3.2.2 色谱条件
• 3.2.3 标准曲线及线性范围
• 3.2.4 rCM样品分析方法的评价
• 3.2.4.1 方法精密度
• 3.2.4.2 方法回收率
• 3.3 模型药物与rCM的结合
• 3.3.1 洗脱曲线
• 3.3.2 模型药物与rCM的结合情况
• 3.4 rCM结合模型与天然乳糜微粒结合模型的相关性分析
• 3.5 基于rCM的药物-rCM结合率与药物理化参数数学关系模型的建立
• 3.6 rCM模型预测能力的评价
• 4. 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文
• 附录