论文摘要
背景和目的：在全世界范围内,非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer,NSCLC）是恶性程度最高和最容易转移的恶性肿瘤之一,死亡率位居各种恶性肿瘤之首。积极探寻调控肺癌侵袭转移相关的分子标志物和治疗靶点并阐明其机制是当前肺癌研究的热点与难点。磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族成员5（Glypican5, GPC5）是最近发现的一种参与调控横纹肌肉瘤、乳腺癌及神经系统肿瘤增殖及转移的新型肿瘤相关基因。新近的肺癌全基因组关联分析（GWAS）表明：GPC5基因特定位点的单核苷酸多态性（SNP）可能导致其低表达并显著增加非吸烟人群罹患肺癌的危险性,GPC5是一个潜在的肺癌抑制基因。然而,迄今为止还没有研究深入阐释GPC5在非小细胞肺癌患者中功能和分子机制。因此,本研究拟首先结合临床大样本评价NSCLC患者中GPC5的表达特征,再通过体内体外研究阐明GPC5调控NSCLC转移侵袭功能并探讨其分子机制。方法：①选择198对来自江苏省肿瘤医院胸外科手术切除的新鲜NSCLC肿瘤及相邻正常肺组织标本,real time PCR检测GPC5、E-钙粘蛋白（E-cadherin）和基质金属蛋白酶9（matrix metal proteinase-9, MMP-9）的基因表达水平,并根据临床病理特征及免疫组化（Immunohistochemical, IHC）结果进一步分析数据。②Real time PCR及Western blot检测人正常支气管上皮细胞株（BEAS-2B）及NSCLC细胞株(（SK-MES-1, A549, H1650, H1975, and SPC-A-1）中GPC5的mRNA及蛋白表达水平。③选择三种NSCLC细胞株（鳞癌细胞株SK-MES-1、吸烟者腺癌细胞株A549和非吸烟者腺癌细胞株H1975）为研究对象,构建过表达GPC5的慢病毒载体并包装病毒,筛选稳定转染过表达GPC5的细胞株；通过体外划痕实验、Transwell小室侵袭实验和CCK-8增殖实验评估慢病毒介导过表达GPC5对NSCLC细胞株迁移、侵袭和增殖能力影响,流式细胞仪PI染色评价过表达GPC5对细胞周期的影响。real time PCR检测E-cadherin和MMP-9表达水平的变化。④尾静脉注射A549肺癌细胞建立裸鼠肺癌被动性转移模型,体内比较过表达GPC5对A549细胞转移能力和裸鼠生存时间的影响。⑤体内及体外实验中,real time PCR及Western Blot检测上皮间质转化（Epithelial Mesenchymal Transition, EMT）相关基因E-cadherin、Snail、Slug, Twist和N-cadherin的蛋白及mRNA表达水平,体外拯救实验观察过表达Twist结合过表达GPC5对A549细胞侵袭能力的影响。结果：我们发现与相邻配对的正常肺组织相比,在鳞癌和腺癌组织中GPC5mRNA表达均较低（平均分别下降18.33及8.75倍,p<0.001）,提示GPC5是潜在的NSCLC抑癌基因。此外,GPC5在鳞癌亚组中的表达也显著低于腺癌亚组（p<0.001）。在Tla,b期的肿瘤组织中GPC5的表达水平明显高于T2a,b期的肿瘤组织（p=0.046）,而T2a,b期和T3,4期的肿瘤组织中GPC5的表达水平未见统计学差别。更重要的是,在有淋巴结转移组（N1-2期）的肿瘤组织中GPC5的表达水平显著低于无淋巴结转移组（NO期）（p=0.002）,且在鳞癌和腺癌亚组中均存在该差异（p分别为0.011及0.032）。GPC5mRNA的低表达与较差的病理分化程度相关（p<0.001）。然而,在吸烟组和未吸烟组中GPC5的表达未发现有显著差别（p=0.054）。此外,我们将这些患者分为四个亚组：吸烟者鳞癌（SCC/S）、非吸烟者腺癌（AC/Non）,吸烟者腺癌（AC/S）,和非吸烟者鳞癌（SCC/Non）。我们发现在吸烟者鳞癌组中GPC5表达显著低于非吸烟者腺癌组（p=0.013）。GPC5mRNA和蛋白表达水平在各种NSCLC细胞株中均显著低于正常支气管上皮细胞株BEAS-2B,特别是SK-MES-1,H1975和SPC-A-1细胞株。所有过表达GPC5的三种细胞株均显著抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力（p<0.001）。与空载体组相比,过表达GPC5组转移抑制基因E-cadherin表达显著上调和转移促进基因MMP9表达显著下调。与阴性对照组相比,过表达GPC5的细胞株的增殖率显著降低。细胞周期分析表明,过表达GPC5的腺癌细胞株（A549和H1975）与阴性对照组相比,有更多的G1期细胞数（分别为76.37%和62.55%,80.39%和57.03%）。与阴性对照组相比,过表达GPC5的细胞株SK-MES-1SCC有一个更多的S期细胞数（51%对31.5%）。总之,GPC5过表达显著抑制NSCLC细胞株的增殖和诱导细胞周期阻滞在G1或S期。在体内,通过建立裸鼠肺癌细胞被动性转移模型,我们发现过表达GPC5能抑制A549细胞转移。与空载体组相比,过表达GPC5组肝转移结节数目及腹围显著减少。注射过表达GPC5的A549细胞的裸鼠的生存率明显大于注射空载体转染A549细胞的裸鼠,对数秩检验显示组间生存率有显著差异（p<0.01）。提示过表达GPC5后,A549细胞的体内转移能力受到显著抑制。体内及体外实验均显示过表达GPC5-A549组较空载体A549组上皮表型E-cadherin蛋白及mRNA表达水平上调,而间质表型N-cadherin蛋白及mRNA表达水平则明显下调,转录因子Snail,Twist及Slug蛋白及mRNA表达水平下降,但Slug mRNA表达水平下降未见统计学意义（p>0.05）。体外拯救实验表明与过表达GPC5的A549细胞相比过表达Twist后过表达GPC5的A549细胞的侵袭能力明显增强（p<0.01）,而过表达GPC5的A549细胞较空载体转染的A549细胞的侵袭能力明显减弱,过表达Twist可抵消过表达GPC5的抑制转移作用。结论：本研究表明在非小细胞肺癌中GPC5的表达水平显著下调,GPC5表达水平低预示着淋巴结转移可能。体内及体外实验均证实GPC5的下调与非小细胞肺癌的转移相关。GPC5可通过抑制转录抑制因子Twist介导的EMT过程从而遏制NSCLC转移。因此,GPC5是一个新的非小细胞肺癌转移抑制基因。
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标签：肺癌论文; 磷脂酰肌醇蛋白聚糖论文; 转移论文; 上皮间充质转化论文; 分子机制论文;