论文摘要
乳酸菌是公认的安全级（Generally regarded as safe, GRAS）微生物,被广泛应用于在食品制造业中。乳酸菌产生的乳酸快速酸化原料,伴随芳香剂、甜味剂、维生素、胞外多糖与细菌素的产生赋予发酵产品优良质地、健康功效和生物安全的特性。但是在工业生产中,乳制品加工原料及发酵过程一般不经过严格高温灭菌,为噬菌体的生存提供了环境。乳酸菌遭受噬菌侵染后菌株产酸能力和蛋白水解能力下降而延迟甚至中止发酵,造成巨大的经济损失。然而噬菌体亦有可利用的一面,其产生的裂解酶具有广谱杀菌活性,作为新型抗菌剂在食品保鲜和噬菌体治疗中表现出潜在应用价值。此外,利用乳酸菌噬菌体裂解素构建可控性裂解生产菌株可以有助于发酵乳后期细胞内酯酶、肽酶等的释放以加速产品的成熟和风味物质的形成。但是,如何控制和有效利用乳酸菌噬菌体的裂解能力,其本质是对其遗传信息的发掘和裂解机制的深入研究。本文主要围绕乳杆菌噬菌体的生物学特性进行研究,首先调查乳杆菌中温和噬菌体的普遍存在,接着测定并分析德氏乳杆菌保加利亚亚种噬菌体的基因组组成,并利用其裂解素构建新型抗菌剂用于对病原微生物的防治；最后完成对发酵乳杆菌温和噬菌体φPYB5双组份裂解系统的作用机制解析。具体研究内容和结果如下：1.溶源性菌株在乳杆菌中的分布乳杆菌是乳制品发酵的重要发酵剂菌株,溶源现象在乳杆菌属中普遍存在。温和噬菌体并非一个存在于细菌染色体中的沉默集团,在一定条件下可以被诱导转变为烈性噬菌体,在实际生产中存在很大隐患。同时温和噬菌体的整合与释放常导致极高频率的基因片段插入、缺失或重排,造成菌株生产性能不稳定。鉴于溶源性菌株的潜在安全隐患,本论文调查了20株乳杆菌的溶源现象,并且检测在实际生产中所用杀菌条件如紫外线照射、过氧化氢处理以及在乳制品的高酸、高盐、细菌素环境下溶源性菌株温和噬菌体的释放。结果发现,经丝裂霉素C诱导6株乳杆菌释放出温和噬菌体,其中包括4株分离自传统发酵乳中的发酵乳杆菌、1株商业用德氏乳杆菌保加利亚亚种和1株商业用发酵乳杆菌。根据噬菌体基因组DNA BamHI限制性内切酶酶切图谱分析,溶源性发酵乳杆菌SDMCC050085与SDMCC050087基因组中存在相同的温和噬菌体,SDS-PAGE分析噬菌体外壳蛋白也证明了这点；并且所有6株温和噬菌体基因组DNA限制性内切酶酶切图谱、噬菌体外壳蛋与已经报道的乳杆菌噬菌体完全不同,说明温和噬菌体存在广泛而多样。并且在生产中常用灭菌条件紫外线照射下6株溶源性菌株均能检测到温和噬菌体,而其它几种在乳制品工厂可能成为诱导剂的过氧化氢、高盐、高酸和乳链菌肽未能诱导出温和噬菌体。2.德氏乳杆菌噬菌体比较基因组分析乳酸菌噬菌体是广泛分布于乳制品发酵中的一个重要生理类群,目前已经有约100株乳酸菌噬菌体的基因组信息公布,其中包含4株德氏乳杆菌噬菌体（LL-H, c5, LL-Ku,JCL1032）。本论文对2株德氏乳杆菌保加利亚亚种烈性噬菌体phiLdb和温和噬菌体phiJB全基因组序列测定,从进化、遗传多样性和基因水平转移等方面对其遗传信息进行分析。噬菌体phiLdb和phiJB基因组为线性双链DNA,大小分别为33,995bp和1136,969bp, GC%为41.95%和47.7%,分别预测有58个ORF和146个ORF。phiLdb全基因组序列与德氏乳杆菌噬菌体LL-Ku和c5的核苷酸一致性90%以上；phiJB基因组与噬菌体LL-H一致性50%。根据比较基因组学分析，这两种噬菌体基因组均由几种功能模块组成,包括DNA复制模块、溶源模块、头部模块、尾部模块和裂解模块等。噬菌体phiJB的DNA复制模块与目前已报道的德氏乳杆菌噬菌体相应模块相似性较低，并且phiJB（?）的GC%高达47.7%,说明phiJB是一个正在快速进化的噬菌体,频繁发生的基因插入、缺失及水平转移导致德氏乳杆菌噬菌体的生物多样性。3.利用噬菌体phiLdb裂解素生产新型抗菌剂双链DNA噬菌体多依赖于由穿孔素-裂解素组成的双组份系统裂解宿主菌释放子代噬菌体颗粒。裂解素是一种细胞壁肽聚糖水解酶,作为抗菌剂具有诱人前景,本文利用噬菌体phiLdb（?）的裂解素Lysdb构建工程菌株生产新型抗菌剂,以实现对食品中常见的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的生长抑制。本文克隆德氏乳杆菌烈性噬菌体phiLdb的裂解素基因lysdb,将其在大肠杆菌中重组表达,测定Lysdb蛋白的裂解能力,表明Lysdb具有较为广泛的裂解谱,尤其是对于食品中常见的病原微生物金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）有较强裂解作用。胞外检测Lysdb在10h内对S. aureus ATCC33591、S. aureus ATCC27217、 L. monocytogenes ATCC19114和L. monocytogenes ATCC19115的裂解效率分别为42.5%,40.2%,69.9%和68.5%,表明Lysdb可以作为抗菌剂用于食品加工。此外,将lysdb基因导入干酪乳杆菌,构建了组成型分泌表达Lysdb的重组菌,与上述病原微生物共培养。结果表明,重组菌Lb. casei/pBLysdb向胞外分泌的Lysdb蛋白能够有效的降低体系中S. aureus和L. monocytogenes的数量,而自身的细胞数目未受影响。4.发酵乳杆菌温和噬菌体φPYB5裂解素Lyb5N-末端功能解析根据发酵乳杆菌温和噬菌体φPYB5裂解素Lyb5在大肠杆菌中单独表达导致细胞缓慢裂解的现象,我们猜测Lyb5可以不依赖于其同源穿孔素Hyb5的帮助即可完成由细胞质到周质空间的跨膜运输。在本文中,为了鉴定Lyb5在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的运输方式,首先利用SignalP4.0预测Lyb5的N-末端具有假定信号肽结构SPLyb5。SPLyb5缺失突变体Lyb5ASP转变为细胞质中无毒性的裂解素,说明SPl.yb5对于Lyb5的跨膜运输是必要的。将Lyb5在大肠杆菌中重组表达,只得到一种重组蛋白,N端测序发现该蛋白与Lyb5推定的氨基酸序列相同；同时定点突变推测信号肽酶酶切位点丙氨酸为色氨酸后不影响Lyb5的运输与功能。以上结果表明Lyb5在大肠杆菌中的合成和跨膜运输均未发生蛋白翻译后加工,即SPLyb5没有如同典型信号肽一样被切割。经过亚细胞定位分析在细胞膜和周质空间中均检测到Lyb5蛋白的存在,并且与细胞质中的Lyb5分子量相同,由此说明Lyb5具有细胞质、细胞膜固定和周质空间游离三种存在形式。在乳酸乳球菌中,我们观察到Lyb5的表达不足以引起细胞裂解,原因是约有50%的Lyb5蛋白被锚定于细胞膜上,在细胞外仅有少于5%的Lyb5存在；若此时加入细胞膜去质子动力势剂DNP,即可引起乳球菌细胞迅速裂解,说明细胞膜能荷状态的改变可以将固定在细胞膜上的Lyb5蛋白释放到周质空间。将SPLyb5与NucB形成的嵌合体蛋白可以在大肠杆菌和乳球菌的细胞质外的空间检测到,表明SPLyb5可运输Lyb5以外的蛋白完成跨膜运输。以上这些结果表明SPLyb5具有信号锚定释放功能,这是在革兰氏阳性菌菌噬菌体裂解素中发现的首例信号锚定释放结构域。5.穿孔素Hyb5拓扑结构分析及二元裂解系统模型构建噬菌体裂解宿主细胞具有时序性特征,其裂解系统中的穿孔素发挥着“分子生物钟”的作用。穿孔素是一种膜蛋白，发酵乳杆菌温和噬菌体φPYB5穿孔素Hyb5是由156个氨基酸残基组成的膜蛋白,其N-端10-29个氨基酸残基形成了一个跨膜结构域（TMD）,N-末端的1-9个氨基酸残基位于细胞膜外,C-末端的30-154个氨基酸位于细胞质,且位于细胞质中的C端是亲水的带电丰富区域,属于第Ⅲ类穿孔素,但与已报道的大肠杆菌噬体T4的穿孔素N-in、C-out的拓扑结构恰好相反。为了寻找控制噬菌体裂解的调控因子,将hyb5中潜在的orf分别与hyb5及hyb5/lyb5共同表达,发现hyb5自身编码的157-465个氨基酸（ORF2）具有推迟裂解时间的作用，推断其具有antiholin的作用。通过Pull-down实验进一步验证Hyb5与ORF2存在紧密的相互作用。使用λ噬菌体裂解素、绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶作为报告基因确定Hyb5在细胞膜上形成孔洞大小，Hyb5属于针孔穿孔素。利用体外交联技术发现Hyb5在细胞膜上发生自身聚合,以同聚四聚体形成针形孔洞。根据Lyb5与Hyb5的结构与功能,我们推测噬菌体φPYB5的裂解模型为：在Hyb5合成过程中ORF2结合无法形成同聚体；在某个遗传特定时机Hyb5与ORF2脱离,自身聚合形成四聚体在细胞膜上产生针孔,改变细胞膜质子动力势激发被锚定在细胞膜上的Lyb5释放到周质空间,Lyb5由无活性转变为有活性形式降解肽聚糖完成细胞破裂。6.利用启动子工程精细调控乳酸乳球菌的代谢流向乳酸乳球菌具有基因组较小、遗传可操作性强和代谢途径简单等优点,已经成为乳酸菌研究的模式菌株。为了精细调控乳球菌末端代谢产物分配,本文利用启动子工程调节细胞内NADH/NAD+比例实现对乳酸和双乙酰两种产物在有氧条件下的合理分配。随机突变乳球菌NADH氧化酶启动子,以gfp为报告基因筛选30个组成型启动子构建组成型启动子库,其强度在7,000到380,000个相对荧光单位之间。从中选择11个强度梯度变化的启动子控制NADH氧化酶基因的表达,使重组乳球菌中该酶的活性在9.43至58.17倍之间逐步增加,细胞内NADH/NAD+比例变化范围在0.711±0.005到0.383±0.003之间。重组菌中相应乳酸产量在21.15±0.08mM至9.94±0.07mM逐渐减少,双乙酰产量由1.07±0.03mM至4.16±0.06mM逐渐增加。结果说明通过改变细胞内NADH/NAD+比例减少乳酸途径流量而流向双乙酰途径。此外,在乳球菌中提高NADH氧化酶水平可以使重组菌株在有氧培养24h后胞内的过氧化氢浓度下降76.95%,并且在4℃存放28天后细胞存活率提高4个数量级。