非培养方法和培养方法对水稻内生细菌和根结合细菌的研究

论文摘要

本文对非培养方法在水稻内生细菌和根结合细菌研究中的应用进行了探索。主要采用了构建16S rRNA基因克隆文库、DGGE两种非培养方法并结合传统的细菌分离培养方法，对水稻（Oryza sativa L.）内生细菌和根结合细菌群落多样性及群落动态变化进行了研究。 建立了直接从水稻根组织扩增内生细菌16S rDNA的方法。选择了扩增细菌16S rDNA的引物（799f-1492r），该对引物可以通过PCR的方法直接从水稻根总DNA中扩增出内生细菌的16S rDNA片段，而不扩增水稻叶绿体DNA。水稻线粒体DNA可通过扩增产物中片段大小差异与细菌的16S rDNA分开。通过对水稻内生细菌16S rRNA基因克隆文库中阳性克隆的序列测定证实该对引物完全适用于非培养的分子生物学方法对水稻内生细菌的研究。该项研究结果尚未见报道。 对分蘖期水稻（Oryza sativa L. japonica 90-3）的内生细菌16S rRNA基因克隆文库中192个阳性克隆的16S rDNA片段进行ARDRA分型，根据ARDRA分型结果将该克隆文库分为52个OTUs；16S rDNA序列系统发育分析揭示水稻根内生细菌中包含α-、β-、γ-、δ-、ε-五个亚类的Proteobacteria，其中γ-Proteobacteria为克隆文库中最优势的细菌类群，占克隆总数的25％。除此之外水稻根内生细菌中还含有低GC的革兰氏阳性细菌及Cytophaga／Flexibacter／Bacteroides（CFB）类细菌。文库中28.64％的克隆与尚未培养的细菌具有较高的序列相似性。该文库中还有6个克隆属于古菌，这是首次通过非培养方法研究证实水稻内生菌群落中包含有古菌。这些结果均说明水稻内生菌具有丰富的种群多样性。 采用构建细菌16S rDNA克隆文库并结合分离培养方法，研究了水稻根结合细菌群落结构。ARDRA分型结果显示，克隆文库包含43个OTUs，分离培养物包含17个OTUs。两种研究方法的结果均说明γ-Proteobacteria为水稻根结合细菌群落中的优势类群。气单胞菌属为克隆文库中的最优势菌群；与16S rDNA克隆文库比较，分离培养物中的最优势菌群则为假单胞菌属。 采用PCR-DGGE技术研究了在水稻生长的不同年份及不同生长时期两个品种的水稻（Oryza sativa L. japonica 90-3，Oryza sativa L. japonica 90-12）根内生细菌和根结合细菌的群落多样性及其动态变化。DGGE图谱中主要条带的序列分析结果显示，水稻内生细菌和根结合细菌群落中均有α-、β-、γ-、δ-四个亚类的Proteobacteria及低GC的革兰氏

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 植物促生细菌的生态学研究
• 1.1.1 植物促生细菌的生物多样性
• 1.1.2 植物促生细菌的功能多样性
• 1.2 植物促生细菌的生态学研究方法
• 1.2.1 培养（Culture-dependent）方法
• 1.2.2 非培养（Culture-independent）方法
• 1.2.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 1.3 基于PCR的非培养方法在植物内生及根际细菌研究中的应用
• 1.3.1 非培养方法在植物内生细菌研究中的应用
• 1.3.2 非培养方法在植物根际细菌研究中的应用
• 1.3.3 研究中存在的问题
• 1.4 结语
• 立论依据及研究思路
• 第二章 16S rRNA基因克隆文库的构建对水稻根内生细菌多样性的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料及生长条件
• 2.1.2 水稻基因组DNA的提取
• 2.1.3 水稻根内生细菌16S rRNA基因克隆文库的构建和分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 水稻根总DNA的提取
• 2.2.2 内生细菌16S rDNA片段的PCR扩增
• 2.2.3 水稻根内生细菌群落16S rDNA克隆文库的构建及检测
• 2.2.4 水稻根内生细菌群落16S rDNA克隆文库的ARDRA分型
• 2.2.5 克隆文库的评价
• 2.2.6 水稻根内生细菌群落16S rRNA基因多样性及系统发育学分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 16S rRNA基因克隆文库的构建和培养方法对水稻根结合细菌群落结构的比较研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料及生长条件
• 3.1.2 水稻基因组DNA的提取
• 3.1.3 水稻根结合细菌16S rRNA基因克隆文库的构建和分析
• 3.1.4 根结合细菌的分离培养
• 3.1.5 分离细菌的ARDRA分型
• 3.1.6 序列测定及同源性比较
• 3.2 结果
• 3.2.1 水稻根的总DNA提取及根结合细菌16S rDNA片段的PCR扩增
• 3.2.2 水稻根结合细菌群落16S rDNA克隆文库的构建及检测
• 3.2.3 16S rRNA基因克隆文库的ARDRA分型结果及文库评估
• 3.2.4 水稻根结合细菌群落16S rRNA基因多样性及系统发育学分析
• 3.2.5 可培养细菌16S rDNA部分序列的ARDRA分型
• 3.2.6 可培养细菌多样性分析
• 3.3 讨论
• 第四章 PCR-DGGE技术对水稻根内生细菌群落及根结合细菌群落动态变化的研究
• 第一节 PCR-DGGE技术和培养方法对水稻根内生细菌群落多样性的比较研究
• 4.1.1 材料和方法
• 4.1.1.1 植物材料
• 4.1.1.2 主要试剂
• 4.1.1.3 水稻根基因组DNA的提取
• 4.1.1.4 细菌16S rDNA的PCR扩增
• 4.1.1.5 PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 4.1.1.6 DGGE图谱遗传多样性分析
• 4.1.1.7 DGGE条带的回收和重新扩增
• 4.1.1.8 DGGE回收条带的克隆和转化
• 4.1.1.9 DGGE条带的序列测定和同源性比较
• 4.1.1.10 根内生细菌的分离培养
• 4.1.2 结果
• 4.1.2.1 不同植物样品基因组DNA的提取
• 4.1.2.2 细菌16S rDNA的PCR扩增
• 4.1.2.3 水稻根内生细菌PCR产物的DGGE垂直胶分离
• 4.1.2.4 水稻根内生细菌多样性的分析
• 4.1.2.5 可培养细菌多样性分析
• 4.1.3 讨论
• 第二节 变性梯度凝胶电泳（DGGE）对水稻根结合细菌群落时空动态变化的研究
• 4.2.1 材料和方法
• 4.2.1.1 植物材料
• 4.2.1.2 主要试剂
• 4.2.1.3 水稻基因组DNA的提取
• 4.2.1.4 细菌16S rDNA的PCR扩增
• 4.2.1.5 PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 4.2.1.6 DGGE图谱遗传多样性分析
• 4.2.1.7 DGGE条带的回收和重新扩增
• 4.2.1.8 DGGE回收条带的克隆和转化
• 4.2.1.9 DGGE条带的序列测定和同源性比较
• 4.2.2 结果和讨论
• 4.2.2.1 不同植物样品基因组DNA的提取
• 4.2.2.2 细菌16S rDNA的PCR扩增
• 4.2.2.3 水平DGGE对水稻根结合细菌群落多样性的分析
• 4.2.2.4 水稻根结合细菌群落遗传多样性分析
• 4.2.2.5 水稻不同品种不同生长时期根结合细菌群落相似性分析
• 4.2.2.6 主要电泳条带的序列测定及细菌多样性分析
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢