论文摘要
团头鲂（Megalobrama amblycephala）是我国重要的草食性经济鱼类之一,因其易饲养,味道鲜美而深受人们喜爱。但是团头鲂属不耐低氧的鲤科鱼类,在养殖过程中易引发缺氧浮头,制约了其养殖产量的提高。缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor,HIF）在动物耐受低氧的生理应答中起关键作用,其活性主要由α亚基决定。HIF能够激活下游一系列氧敏感基因的转录,来调控诸如能量代谢、血管生成以及细胞增殖和凋亡等生理过程,从而维持机体在缺氧状态下的存活。目前鱼类中已发现HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α三种α亚基,但是对它们的分子结构、表达特征以及缺氧状态下的调控机制了解的还很有限,因此通过研究HIF-αs的结构和功能对解释团头鲂不耐低氧的分子机制和培育耐低氧团头鲂有着重要的意义。本研究通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了低氧敏感鱼类团头鲂HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α的cDNA全长序列,分别为3815bp、3121bp和3059bp,其开放阅读框分别为2325bp、2508bp和1932bp,编码774、835和643个氨基酸。序列分析表明三个团头鲂HIF-α基因均属于bHLH家族。HIF-1α、HIF-2α和HIF-3αN端均含有结合靶DNA,以及和形成二聚体相关的结构域bHLH和PAS（PAS-A和PAS-B）,且N端结构域在三个HIF-α中具有较高的相似度,达到了56.4%81.8%;HIF-1α和HIF-2αC端含有与激活靶基因转录相关的两个反式激活区N-TAD和C-TAD,而HIF-3α仅含N-TAD域,且该结构域在三个HIF-α之间相似度较低仅为39.3%57.1%。通过RT-PCR和整胚原位杂交分析了团头鲂胚胎发育各阶段以及成鱼各组织中HIF-1α、HIF-2α和HIF-3αmRNA的表达模式。在常氧状态下,团头鲂胚胎发育各阶段中HIF-1α和HIF-3α表达量较为恒定,差异不显著;而HIF-2α在受精后8h、28h、48h和52h表达水平显著高于其他时相。团头鲂成鱼中,HIF-1α、HIF-2α和HIF-3αmRNA在常氧状态下,所有被检测组织中均有表达,其中HIF-1α在肝脏、鳃和精巢中表达水平较高;HIF-2α在除肠和肌肉以外的其他组织中均有较高表达;而HIF-3α在各组织中表达量较为稳定。缺氧胁迫4h后,HIF-2αmRNA水平在肝和肾中分别显著上升了910%和320%,但脑中没有明显变化; HIF-3αmRNA在脑、肝和肾中表达量均显著升高,分别为对照组的218%、603%和293%;但是HIF-1αmRNA水平在相应的组织中没有明显变化。研究结果暗示团头鲂HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α在生长发育以及缺氧应答过程中发挥了不同的功能。为了更深入研究团头鲂HIF-3α的功能,通过构建pCS2-HIF3α-eGFP表达载体转染hela细胞,对团头鲂HIF-3α蛋白分布进行了亚细胞定位分析,结果显示HIF-3α蛋白在细胞质和细胞核中均有分布,但主要集中在细胞核内。通过定点突变技术,将团头鲂HIF-3αODD域内位于第409和509的两个保守的脯氨酸突变为丙氨酸,并在团头鲂胚胎中进行了双突变型HIF-3αmRNA的过表达研究,结果表明过表达突变型HIF-3αmRNA对团头鲂的胚胎发育无影响。进一步构建了基于Tgf2转座系统的转基因载体pTgf2-zfβ-actin- HIF3αΔ409/509,并在团头鲂中进行了初步的转基因研究。本研究为深入探索团头鲂应对缺氧环境生理适应的分子机制提供了实验依据,并且为培育耐低氧的团头鲂良种积累了资料。