论文摘要
研究背景系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种免疫性疾病的原型,其特征为患者体内T、B淋巴细胞功能异常、产生病理性自身抗体（例如抗DNA抗体）、以及免疫复合物（immune complexes,IC）的出现。自身抗体和免疫复合物的沉积可引起多器官的炎症和损伤,SLE的临床表现各异,包括肾小球肾炎、皮炎、血栓形成、血管炎、癫痛发作、关节炎等,是一种十分复杂的疾病,又称为多因子疾病（multifactorialdisease）。虽然针对SLE的病因和发病机制,已经提出过很多学说,包括自身免疫学说、遗传学说、遗传和环境交互作用学说等,但到目前为止,仍然不清楚SLE发生的确切原因。最近Toll样受体家族在SLE发病中的作用越来越受到重视,特别是Toll样受体9（toll-like receptor,TLR9）。TLR9是免疫学研究的一个热点,它的配体是低甲基化CPG-DNA。TLR9是免疫学中的一个热点问题,在狼疮的发病中作用有很多的争论。在体内和体外,在不同的种系如鼠和人中,TLR9对狼疮的保护性和促发性作用都有报道,表明在探求TLR9在狼疮发病中作用过程中,不同的种系、遗传背景、环境条件都有影响。在SLE中存在Th1/Th2免疫的失衡,T-bet （T-box transcription factor,Tbx21）是Th1型转录因子。近来,T-bet被认为同TLR9一样,是天然免疫和获得性免疫的桥梁。一些文献报道,TLR9对于抗DNA抗体的产生很特异,并且TLR9的缺失会导致T-bet产生的下降。T-bet在B、T效应细胞的产生或维持中具有重要意义,在鼠狼疮模型中能够调节IgG2a型抗体生成。所以,T-bet可能存在于TLR9激活到抗体生成的中间环节。TLR9和T-bet与病理性抗体的生成具有密切关系,并在SLE病理中发生作用,特别是两者之间也是紧密相关的。为了辨别清楚TLR9以及TLR9-T-bet-抗体通路在SLE病理中的作用,本次研究用流式细胞仪检测了新发未治型SLE病人及正常对照的外周血B、T细胞中TLR9、T-bet的表达。目的比较系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）患者和正常对照两组间,TLR9/T-bet（TLR9或/和T-bet）在外周血B/T（B或/和T）细胞中的表达、以及共表达（即,TLR9、T-bet在B/T细胞中共表达）水平（统称为TLR9/T-bet在B/T细胞中表达情况）。分析TLR9/T-bet在外周血B/T细胞中的表达、以及TLR9、T-bet在B/T细胞中共表达水平与SLE疾病活动度、临床实验室指标、临床症状之间的关系,以及TLR9、T-bet之间的关系,探讨TLR9-T-bet通路在SLE病理中的作用。方法病例组选自两所三甲医院住院SLE患者,以健康个体为正常对照,参照系统性红斑狼疮疾病活动性指数（systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI）、SLE的诊断及分类标准量表,设计问卷,收集患者的一般流行病学情况、临床表现和临床实验室数据。利用流式细胞仪,采用FITC、PE、PE-Cy5三染色法检测外周血B、T细胞中TLR9、T-bet表达量,抗体包括FITC标记抗T-bet抗体、PE标记抗TLR9抗体、PE-Cy5标记抗CD3抗体、PE-Cy5标记抗CD19抗体等流式细胞仪用荧光标记抗体。用SPSS软件分析资料间的差异和相关关系。结果TLR9/T-bet在B/T细胞中表达情况在SLE患者中较正常对照在统计学上显著升高。TLR9/T-bet在B/T细胞中表达情况与SLEDAI分数、抗dsDNA抗体的血清学水平、以及SLE患者临床症状中浆膜炎、血液系统病变、脉管炎、管型尿、脓尿、胸膜炎、白细胞下降、血小板下降的出现成统计学上显著负相关,与IgA、IgM、抗C1q抗体血清学水平、SLE患者临床症状中结核、干燥综合症、肾病变、血尿的出现成统计学上显著正相关、与临床症状中肌炎的出现有显著正或负相关。结果数据为以下这些方面。SLE患者表达TLR9阳性的B细胞百分比显著高于正常组,分别为53.94±17.95%,29.40±10.54%, p =0.000。SLE患者表达T-bet阳性的B细胞百分比显著高于正常组,分别为22.77±16.80%,11.46±6.56%,p =0.001。SLE患者表达TLR9阳性的T细胞百分比显著高于正常组,分别为49.33±23.30%,29.18±14.78%, p =0.001。TLR9阳性B细胞百分比与SLEDAI分数成统计学上的显著负相关, p =0.020, r =-0.392。尚未发现SLEDAI分数与其他TLR9/ T-bet在外周血B/T上的表达情况成显著性关联。C1q抗体血清学水平与表达T-bet阳性B细胞百分比有显著正关联, p =0.011, r =0.424。IgA血清学水平与表达TLR9阳性、T-bet阳性以及共表达TLR9、T-bet阳性的B细胞的百分比成显著正关联,分别为p =0.000,r =0.742,p =0.006,r =0.458,p =0.014, r =0.422。除了测定了表达TLR9和T-bet阳性的细胞的百分比,本次研究还测定了平均荧光密度（mean fluorescence intensity, MFI,这里指每个B/T细胞表达TLR9/T-bet的强度）。在临床实验室数据和MFI之间,本次研究发现一些显著性的关联。抗dsDNA抗体的血清学水平与共表达T-bet和TLR9阳性的B细胞MFI间有显著负相关,p < 0.000, rs =-0.582;但是与共表达T-bet和TLR9阳性的B细胞百分比间没有显著相关性。IgM血清水平与共表达T-bet、TLR9阳性的T细胞的MFI显著正关联,但是与共表达T-bet和TLR9阳性的T细胞百分比间没有显著相关性,p =0.001, r =0.540。尚未发现患者中外周血T、B表达TLR9、T-bet的水平与抗核抗体、抗核小体抗体、CRP、C3、C4血清水平及ESR有显著关联。T、B细胞表达TLR9、T-bet阳性百分比与表达TLR9、T-bet荧光密度成正比。浆膜炎阴性的SLE患者表达TLR9细胞阳性的T的百分比为51.32±23.85%较浆膜炎阳性的SLE患者的33.90±10.10%高,有统计学显著性, p <0.05。血液系统病变阴性的患者表达T-bet阳性的T细胞的百分比为35.82±16.08%较阳性的患者的25.38±13.93%高,有统计学显著性, p <0.05。脉管炎阴性的SLE患者表达TLR9阳性的T细胞的百分比为51.65±23.02%,较脉管炎阳性的SLE患者的24.60±3.42%高,有统计学显著性, p < 0.01。肌炎阴性的SLE患者表达TLR9细胞阳性的B的百分比为54.94±18.01%较肌炎阳性的SLE患者的37.45±0.64%高,有统计学显著性,p <0.01。管型尿阴性的SLE患者表达TLR9细胞阳性的B的百分比为56.84±17.15%较管型尿阳性的SLE患者的36.52±12.79%高,有统计学显著性, p <0.05。脓尿阴性的SLE患者表达TLR9细胞阳性的B的百分比为57.63±16.28%较脓尿阳性的SLE患者的43.27±19.22%高,有统计学显著性,p <0.05。胸膜炎阴性的SLE患者表达TLR9细胞阳性的T的百分比为52.05±23.91%较胸膜炎阳性的SLE患者的33.00±8.98%高,有统计学显著性,p <0.01。无白细胞下降的SLE患者表达TLR9阳性的B细胞的百分比为60.68±17.44%有白细胞下降的SLE患者的48.26±16.76%高,有统计学显著性, p < 0.05。不过,在结核患者与上述的情况正好相反。有结核并发症的SLE患者表达T-bet阳性的B细胞的百分比为49.55±27.65%较无结核的SLE患者的21.15±15.12%高,有统计学显著性,p < 0.05。没有血小板下降的SLE患者表达TLR9阳性的B细胞MFI为17.04±9.91,较有血小板下降的SLE患者的10.93±1.64高,有统计学显著性, p <0.01。肌炎阴性的患者表达T-bet的T细胞的MFI为16.03±3.64,较阳性的患者的21.65±5.44低,有统计学显著性,p <0.05。有肾病变的SLE患者表达TLR9的B细胞的MFI为19.48±11.74较无肾病变的SLE患者的12.46±4.42高,有统计学显著性,p < 0.05。有血尿的SLE患者表达T-bet的B细胞的MFI为20.75±5.95较无血尿的SLE患者的17.13±4.20高,有统计学显著性, p <0.05。有干燥综合征的SLE患者表达T-bet阳性的B细胞的MFI为25.33±8.60,较无干燥综合征的SLE患者的17.83±4.40高,有统计学显著性, p <0.05。共表达TLR9和T-bet阳性的B细胞百分比,在有血液系统病变的SLE患者中较无血液系统病变的要低,分别为10.16±5.42%,18.88±15.07%,p <0.05。而且,TP,共表达TLR9和T-bet阳性的T细胞百分比,在有血液系统病变的SLE患者中较无血液系统病变的要低,11.20±7.04%,24.8±15.47%,p <0.05。共表达TLR9和T-bet阳性的T细胞百分比,在有血小板下降的SLE患者中较无血小板下降SLE患者中要低,分别为10.16±6.63%,20.50±14.47%, p <0.05。共表达TLR9和T-bet阳性的T细胞百分比,在有白细胞下降的SLE患者中较无白细胞下降的SLE患者为低,分别为12.70±7.93%,23.95±16.48%, p <0.05。同CD19TLR9与白细胞下降关系相似。即共表达TLR9和T-bet阳性的B细胞百分比,在结核的SLE患者中较无结核的SLE患者为高,分别为44.65±32.60%,12.56±7.49%,p <0.01。结论总的来说,TLR9和T-bet在SLE病人中表达是升高的,TLR9和T-bet共表达升高对红斑狼疮发病起到抑制性作用。TLR9、T-bet共表达的增高有利于保护性抗体水平（如IgA、IgM等）升高及病理性抗体水平（如抗ds-DNA抗体）的降低。TLR9/T-bet表达与SLE分类标准和评分标准所涉及的大部分症状出现成反向关系,但与肾病变的血尿及并发症出现成正相关。TLR9、T-bet共表达可以作为狼疮消退指标,对用药起到参照作用。