论文摘要
目的:尿激酶型纤溶酶原激活物受体（urokinase plasminogen activator receptor, uPAR）在几乎所有人类肿瘤中高表达,其高表达与增强肿瘤增殖、迁移、侵袭有关。二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）可抑制人胃癌细胞增殖与分化,并且,引起uPAR基因表达下调,但其具体机制不明。因此本研究通过沉默uPAR基因,观察其对DADS人胃癌细胞迁移与侵袭的影响,探讨DADS抑制人胃癌细胞作用的分子机制。方法:1.根据GeneBank提供uPAR基因序列设计4条RNA干扰序列,命名为miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4,并设计1条非特异性序列作为阴性对照。合成各自的寡核苷酸链,退火后与miRNA表达载体pcDNATM6.2- GW/EmGFPmiR连接,转化扩增后测序,将含靶向uPAR的miRNA的质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-uPAR转染MGC803细胞,建立稳转细胞系,通过Western-blot验证miRNA-uPAR对uPAR表达的抑制作用;2. RT-PCR、免疫细胞化学、划痕实验和侵袭实验分析沉默uPAR对DADS抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭的影响。结果:1.重组pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-uPAR-miRNA质粒经DNA测序分析证明重组载体构建成功,荧光显微镜下观察可见转染细胞内的绿色荧光。RT-PCR结果显示,与未转染组相比,转染uPAR-miRNA后使人胃癌MGC803细胞内uPAR基因表达均明显降低（P<0.05）。Western-blot结果显示,与未转染组相比,转染uPAR-miRNA后使人胃癌MGC803细胞内uPAR蛋白表达均明显降低（P<0.05）。2. RT-PCR结果显示,DADS抑制人胃癌MGC803细胞uPAR基因的表达。30mg·L-1 DADS作用MGC803细胞12h、24h、48h后,uPAR基因灰度值比对照组低,而且随时间增加逐渐降低（P<0.05）,表明DADS对人胃癌细胞uPAR基因的表达具有明显抑制作用,且呈显著的时间-效应依赖关系（P<0.05）。3.划痕实验结果显示,取0小时和24小时观察划痕愈合情况,与未转染组比较,uPAR-miRNA转染组细胞划痕愈合较慢,说明其迁移能力被抑制。而空载体组细胞迁移能力无明显改变（P>0.05）。DADS处理后,各组细胞迁移距离均缩小,但miRNA干扰uPAR表达后的两组细胞经DADS处理后,其细胞迁移距离明显低于DADS处理的未转染组（P<0.05）,说明抑制uPAR敲除增强了DADS诱导的迁移抑制作用。4. Transwell实验结果显示,30mg·L-1DADS分别作用MGC803细胞24h后,随机取10个高倍视野进行穿过基质胶的细胞计数。uPAR-miRNA转染可使MGC803细胞计数明显低于未转染组（P<0.05）,说明干扰uPAR表达抑制细胞侵袭。而阴性转染组增殖率无明显改变（P>0.05）。30mg·L-1 DADS处理uPAR-miR3转染组MGC803细胞24h后,细胞计数均明显低于DADS处理的未转染组（P<0.05）,表明干扰uPAR表达可增强DADS对MGC803细胞的侵袭抑制作用。结论:1. miR-uPAR干扰载体（pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-uPAR）转染细胞后可明显抑制人胃癌MGC803细胞中uPAR表达。2. microRNA抑制uPAR表达后,可抑制人胃癌MGC803细胞增殖、迁移、侵袭,并且增强DADS的增殖抑制及迁移、侵袭阻滞作用,说明uPAR表达下调可能是DADS抑制人胃癌细胞作用的分子机制之一。