异体反应性NK细胞诱导供者特异性耐受的作用机理初探

论文摘要

目的：探讨异体反应性NK细胞在非清髓骨髓移植中诱导供者特异性耐受的作用机理。方法：以近交系C57BL／6J（H-2Db）雌鼠为受鼠，C57BL／6J×BALB／c杂交F1代(H2Db/d)雌鼠为供鼠，以氟达拉滨与环磷酰胺为移植前的非清髓化疗方案，进行H-2单倍体骨髓移植。应用高强度磁珠分选系统纯化供鼠NK细胞亚群。分选前后NK细胞的纯度用流式细胞仪检测；采用LDH释放法检测磁珠分选后的NK细胞对Yac-1淋巴瘤细胞、自体及异体淋巴细胞的杀伤。按照对C57小鼠预处理条件的不同分为两组：A组先行化疗预处理，再行骨髓移植；B组行化疗预处理后，输注供鼠NK细胞的同时行骨髓移植。用流式细胞仪检测移植后90天内A、B两组小鼠脾脏和骨髓中H-2Dd细胞比例，检测供体嵌合情况；以F1代小鼠脾细胞作为刺激细胞，移植后7天、14天、21天、28天的两组小鼠及正常C57小鼠的脾细胞作为效应细胞行单向混合淋巴细胞培养；以F1代小鼠脾细胞作为刺激细胞，以正常C57小鼠的脾细胞作为效应细胞，并分别加入移植后23天A组和B组的不同浓度CD4+细胞、CD8+细胞、CD4+CD25+细胞与CD4+CD25-细胞行单向混合淋巴细胞培养；用流式细胞法比较移植后14天、23天A组和B组脾脏的调节性T细胞的变化；用实时荧光定量RT-PCR法检测移植后23天A组和B组脾脏、胸腺CD4+CD25+和CD4+CD25-中IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β、IFN-γ、FoxP3的mRNA水平；应用ELISA法检测在供受者混合淋巴细胞培养体系中加入A组与B组不同剂量的CD4+细胞、CD4+CD25+细胞后，其上清中IFN-γ的分泌量；采用A组和B组移植后14天的胸腺分选的CD11c+细胞与正常C57小鼠的脾细胞分选的CD3+细胞体外共孵育培养5天，采用流式细胞法比较两组调节性T细胞的变化并应用ELISA法检测其对供者特异性IFN-γ分泌情况的影响。结果：分选前脾脏单个核细胞中NK细胞的比例为（19．85±4．27）％，分选后NK细胞的比例为（74．63±5．5）％；NK细胞亚型对Yac-1细胞的杀伤活性为（65．52±8．76）％；F1代小鼠纯化NK细胞亚型对异体C57小鼠淋巴细胞的杀伤活性为（60．18±1．03）％；而受体的NK细胞对自体的淋巴细胞无杀伤活性，说明异体反应性NK细胞具有杀伤活性。B组与A组比较，H-2Dd细胞比例明显增高，移植后28天A组小鼠脾脏嵌合率为（7．50±0．70）％，骨髓中供体细胞嵌合率为（10．20±2．40）％，B组小鼠脾脏嵌合率为（46．20±5．00）％，骨髓嵌合率为（28．7±5．9）％，两组之间比较有统计学意义，P<0．01，两组在60天时仍有差别，在90天时B组脾脏H-2Dd细胞比仍高于A组，而骨髓中的嵌合率无明显差异；混合淋巴细胞培养结果显示，与正常C57小鼠相比，A、B两组小鼠的淋巴细胞增殖比例降低，而B组小鼠增殖比例的降低程度比A组要高，移植后28天正常C57小鼠的刺激指数是（1．48±0．23），A组是（1．14±0．13），B组是（0．91±0．05），组间比较有统计学意义，P<0．01；在以F1代小鼠淋巴细胞与正常C57小鼠的淋巴细胞进行的混合淋巴细胞培养中加入移植后23天两组不同浓度的的CD4+细胞、CD8+细胞、CD4+CD25+细胞与CD4+CD25-细胞，结果表明其中起增殖抑制作用的细胞是CD4+细胞而不是CD8+细胞，并且是CD4+CD25+细胞而不是CD4+CD25-细胞。流式细胞检测结果示在移植后23天B组脾脏出现CD4+CD25+CD127-Treg细胞，而A组则无。实时荧光定量RT-PCR法结果显示：A组脾脏和胸腺的IFN-γ的含量均比B组高，而B组的FoxP3比A组高，两两比较较有统计学意义，P<0．05；此外在脾脏A组的IL-2较B组高，而在胸腺则表现为A组的IL-4较B组高，两组之间比较具有统计学意义，P<0．05。体外诱导的结果显示来自B组胸腺的CD11c+细胞可诱导C57小鼠产生CD4+CD25+CD127-Treg细胞，并且在F1与C57小鼠淋巴细胞共孵育时加入该Treg细胞，可使其IFN-γ分泌减少。结论：异体反应性NK细胞在单倍体非清髓骨髓移植中促进移植物的植入，并诱导宿主免疫耐受的形成。在这一过程中，由胸腺CD11c+细胞诱生的Treg细胞参与并起了重要的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• NK细胞与异基因造血干细胞移植
• 综述参考文献
• 致谢