拟南芥抗灰霉病相关基因AtBRG1的功能研究

论文摘要

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）寄主范围广泛,能够侵染水果、蔬菜等200多种植物,常给农业生产造成重大的经济损失。拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组最小,约为130 Mb,体细胞中仅有5对染色体,是研究植物与病原菌互作的模式植物。近几年克隆的植物抗病基因（R gene）和抗性相关的基因大多是从拟南芥中获得的。本实验室前期研究利用DDRT-PCR、RACE技术获得了一个拟南芥Col-0生态型抗灰霉病相关基因BRG1。为明确BRG1基因的功能及其在抗病途径中的作用,本研究利用基因的原核表达技术,初步验证了诱导表达的BRG1蛋白对灰葡萄孢孢子的萌发具有一定的抑制作用。通过对比分析拟南芥野生型Col-0与BRG1基因的T-DNA插入突变体brg1,初步确定了BRG1基因在拟南芥抗灰霉病及抗逆境过程中的作用。利用基因的互补回复和超表达试验验证了BRG1基因在拟南芥抗灰霉病过程中的作用。试验构建了BRG1基因的原核表达载体,对该基因进行体外表达,将诱导表达的活性菌体蛋白进行抑菌试验,确定了诱导表达的BRG1蛋白对灰葡萄孢的孢子萌发具有一定的抑制作用。从拟南芥SALK库中获得了BRG1基因的T-DNA插入突变体brg1。利用PCR、Southern blotting和RT-PCR技术对突变体brg1进行了鉴定,获得了纯合的突变体brg1,确定了突变体brg1为BRG1基因部分敲除突变体。对突变体brg1和野生型Col-0进行灰葡萄孢接种,发现野生型表现典型的抗病,而突变体植株表现出明显的感病症状,初步确定了BRG1基因与拟南芥对灰葡萄孢的抗性相关。对brg1突变体进行了一系列的非生物胁迫,发现BRG1基因在抵抗某些非生物胁迫中起一定的作用。利用RT-PCR技术,检测brg1突变体中一些抗病途径的相关基因及防御酶基因的表达情况。初步确定了BRG1基因的突变对某些抗病途径的相关基因和防御酶基因的表达有一定的影响。构建AtBRG1基因的表达载体pCAMBIA1300/BRG1（含启动子和终止子）,经农杆菌介导转化brg1突变体和Col-0生态型,获得了回复和超表达转基因株系;经PCR鉴定,确定了表达载体pCAMBIA1300/BRG1成功整合到brg1突变体和Col-0生态型基因组中;经RT-PCR分析,确定了回复转基因系中的BRG1基因的表达量得到恢复,超表达株系中BRG1基因的表达量高于野生型。对拟南芥野生型Col-0、brg1突变体、回复转基因系和超表达转基因系接种灰葡萄孢,发现Col-0生态型和回复株系接种后出现过敏性坏死斑点,brg1突变体接种后则表现明显的感病症状,超表达株系则表现免疫。进一步验证了BRG1基因在拟南芥抗灰葡萄孢侵染过程中具有重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 供试拟南芥、载体及菌株
• 2.2 供试培养基、营养液和转化介质的配制
• 2.3 供试试剂
• 2.4 主要仪器
• 2.5 拟南芥的种植
• 2.6 拟南芥基因组DNA、总RNA 的提取及CDNA 的合成
• 2.6.1 拟南芥基因组DNA 提取
• 2.6.2 拟南芥总RNA 的提取及cDNA 的合成
• 2.7 BRG1 基因的原核表达及其对灰葡萄孢的作用
• 2.7.1 BRG1 基因的克隆
• 2.7.2 表达载体的构建
• 2.7.3 目的蛋白的表达
• 2.7.4 表达蛋白的Western Blotting 分析
• 2.7.5 pET-28a（+）/BRG1 融合蛋白的抑菌实验
• 2.8 BRG1 突变体的鉴定及BRG1 基因的功能分析
• 2.8.1 brg1 突变体的鉴定
• 2.8.2 brg1 突变体的抗病性测定
• 2.8.3 brg1 突变体的非生物胁迫试验
• 2.8.4 brg1 突变体的RT-PCR 分析
• 2.9 BRG1 基因的互补回复和超表达试验
• 2.9.1 BRG1 基因表达载体的构建
• 2.9.2 农杆菌的转化
• 2.9.3 拟南芥的遗传转化
• 2.9.4 转基因阳性苗的筛选
• 2.9.5 转基因植株的PCR 鉴定
• 2.9.6 转基因植株的RT-PCR 鉴定
• 2.9.7 转基因株系的表型验证
• 3 结果与分析
• 3.1 BRG1 基因的原核表达及其对灰葡萄孢的作用
• 3.1.1 BRG1 基因的PCR 扩增
• 3.1.2 pMD19/BRG1 和pET28a（+）双酶切的结果
• 3.1.3 重组质粒的PCR 检测
• 3.1.4 目的蛋白的表达
• 3.1.5 BRG1 基因对灰葡萄孢萌发的作用
• 3.2 BRG1 突变体的鉴定及BRG1 基因的功能分析
• 3.2.1 brg1 突变体的PCR 鉴定
• 3.2.2 brg1 突变体中T-DNA 的插入拷贝数分析
• 3.2.3 brg1 突变体的RT-PCR 鉴定
• 3.2.4 brg1 突变体的抗病性测定
• 3.2.5 brg1 突变体的非生物胁迫试验
• 3.2.6 brg1 突变体的RT-PCR 分析
• 3.3 BRG1 基因的互补回复和超表达试验
• 3.3.1 BRG1 基因表达载体的构建及拟南芥转化
• 3.3.2 转基因阳性苗的筛选
• 3.3.3 转基因株系的分子鉴定
• 3.3.4 转基因株系的RT-PCR 验证
• 3.3.5 转基因株系的表型验证
• 4 讨论
• 4.1 BRG1 基因与拟南芥抗灰葡萄孢之间的关系
• 4.2 BRG1 基因与抗病防御途径之间的关系
• 4.3 下一步工作
• 4.3.1 BRG1 基因所属抗病途径的确定
• 4.3.2 双向电泳技术获得差异表达蛋白
• 4.3.3 酵母双杂交技术筛选BRG1 蛋白的互作蛋白
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢