犬穿透性角膜移植术实验研究

论文摘要

为探索在小动物临床开展角膜移植的术式，探讨影响手术成功率的相关因素及其控制方法，选择11只年龄在6～12月、体重为4.0～6.5 Kg的西施犬、北京犬或小型杂交犬，进行穿透性角膜移植实验。术后密切观察受体犬的的整体及眼部炎症表现，并于术后30 d内每5 d和30 d后每10 d采集受体犬外周静脉血，应用放射免疫学方法检测血清TNF-α、IL-2和β-EP的含量，研究它们的动态变化；对手术成功犬于术后2个月或更长时间，对因缝线松脱、前房泄漏致虹膜前粘连的犬在淘汰时，均取其完整角膜用10％福尔马林液固定，采用H.E染色法染色，于视频生物显微镜下观察角膜植片、植床的变化情况；最后采用PCR技术和DNA序列测定技术分析穿透性角膜移植供、受体犬的DLA-DRBl基因及其同源性，对比穿透性角膜移植所选品种及术后角膜反应，探索了供、受体DLA-DRB1基因同源性对在健康角膜植床施行穿透性角膜移植术的影响。结果如下：1犬实验性穿透性角膜移植的手术效果在10只受体犬中，有5只犬于术后观察2个月角膜植片或植片中央保持透明，5只犬因先后发生缝线松脱、前房泄漏和虹膜前粘连而失败。实验结果表明，犬角膜移植术除眼局部麻醉外，尤其需要可靠持久的头位保定及全身麻醉，而采用异丙酚-氯胺酮复合静脉滴注能够提供麻醉的持久性、安全性和停止静滴后的快速苏醒；术前肌肉注射0.05 mL／Kg速眠新对犬镇静，良好地完成缩瞳、降眼压等步骤，在异丙酚-氯胺酮静脉维持麻醉下均匀一致地缝合角膜并确保前房重建，均为影响角膜透明性和移植成功率的重要技术操作。2犬穿透性角膜移植术后外周血清TNF-α的动态变化对受体犬术前、后的外周血TNF-α含量进行检测显示，术后与术前相比均呈不同程度升高，其中术后第10 d的外周血TNF-α含量与术前相比，差异极显著（P＜0.01）；术后第15 d的外周血TNF-α含量与术前相比，差异显著（P＜0.05）；手术30 d之后外周血TNF-α含量逐步接近术前水平。实验结果表明，犬同种异体角膜移植手术很少发生亚急性免疫排斥反应，即使发生排斥反应，其反应程度较轻。3犬穿透性角膜移植术后外周血清IL-2的动态变化犬穿透性角膜移植术后的外周血IL-2含量与术前相比，均呈不同程度的升高，并随局部刺激或炎症程度的改变发生相应的变化。实验结果表明，检测血清中的IL-2含量可以作为判断角膜移植术后局部刺激或炎症程度及其转归的重要参考指标。4犬穿透性角膜移植术后外周血清β-EP的动态变化犬穿透性角膜移植术后5 d的外周血β-EP水平与术前相比，均呈不同程度的升高，此后各受体犬β-EP水平呈明显的波动性，总体变化缺乏规律。实验表明，熟练的角膜移植操作技术、选用良好的单丝尼龙缝线、角膜间断缝合后尽力埋入线结，以及术后早期使用适当的镇痛剂，以缓解角膜疼痛，有利于防止受体犬术后抓挠和摩擦术眼，避免自残，提高角膜移植手术的成功率。5犬穿透性角膜移植术后角膜病理组织学观察完全透明的植片与植床结构一致，仅两者对合处上部纤维紊乱，而下方纤维排列整齐；中央透明的植片与植床对合不良，植片向植床方向嵌入，后弹力层皱缩、折叠，植片下方因有来自植床的基质纤维而增厚，部分对合处与虹膜粘连；浑浊的植片有比较完整的上皮层，植片约2／3深度的基质丧失原来纤维整齐排列结构，代以大量成纤维细胞增生。实验结果表明，优良的角膜缝合能够保持角膜结构基本不变，维持角膜的透明性；缝合不良可引起角膜组织结构明显改变，导致角膜透明性降低以致于浑浊。提示选择高倍的手术显微镜，对提高手术缝合的准确性，确保穿透性角膜移植术后植片透明具有重要意义。6．DLA-DRB1基因同源性对犬穿透性角膜移植的影响采用PCR技术扩增的犬DLA-DRB1基因片断经双向测序（4号、7号犬除外）分析显示，同为北京犬的1号与10号、同为西施犬的5号与11号的DRBl基因序列具有95％以上的同源性，而人为随机配对的供、受体犬DRB1基因序列同源性均在90％以下。对比穿透性角膜移植实验所选品种及移植结果，初步表明，在无亲缘关系的个体中选择供体进行犬穿透性角膜移植时，应首选同品种配对，并在有条件时进行供、受体DLA分型或DRB1基因序列同源性比对，很可能会降低角膜移植术后的炎症反应程度。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号与缩略语
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 文献综述
• 第一章 角膜移植术研究进展
• 1 医学角膜移植术研究进展
• 2 兽医角膜移植术研究进展
• 第二章 角膜的组织结构与生理
• 1 角膜的组织结构
• 1.1 上皮细胞层
• 1.2 前弹力层
• 1.3 基质层
• 1.4 后弹力层
• 1.5 内皮细胞层
• 2 角膜的生理特点
• 第三章 供体角膜的选择与保存
• 1 供体角膜的选择
• 2 供体角膜的保存
• 2.1 角膜短期保存法
• 2.2 角膜中期保存法
• 2.3 角膜长期保存法
• 第四章 角膜移植手术方式
• 1 PKP基本术式
• 1.1 术前准备
• 1.2 术式
• 1.3 术后护理
• 2 LKP基本术式
• 2.1 术前准备
• 2.2 术式
• 2.3 术后护理
• 第五章 角膜移植的免疫学
• 1 角膜的免疫赦免机制
• 1.1 角膜的局部解剖因素
• 1.2 前房的免疫抑制环境
• 1.3 前房相关免疫偏离
• 1.4 FAS/FAS配体介导的免疫细胞死亡
• 2 角膜的免疫排斥反应
• 2.1 角膜免疫排斥的移植抗原
• 2.2 角膜免疫排斥的类型与发生机制
• 3 角膜移植排斥反应的诊断
• 3.1 临床、裂隙灯显微镜观察
• 3.2 临床型共焦显微镜观察
• 3.3 角膜厚度超声测量
• 3.4 角膜印迹细胞学检查
• 3.5 泪液自由基和水溶性脂质过氧化物检测
• 3.6 外周血肿瘤坏死因子含量测定
• 4 角膜移植排斥反应的防治
• 4.1 组织配型
• 4.2 减少供体抗原量
• 4.3 抗免疫排斥药物的应用
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第六章 犬实验性穿透性角膜移植术
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 猪眼角膜植片在4℃玻璃湿房的厚度变化
• 2.2 手术放大镜下的角膜缝合训练结果
• 2.3 犬穿透性角膜移植实验结果
• 3 讨论
• 3.1 猪眼角膜植片的有效保存时限
• 3.2 手术放大镜下的角膜缝合训练
• 3.3 犬穿透性角膜移植的保定与麻醉方法
• 3.4 穿透性角膜移植手术的几个重要操作
• 参考文献
• 第七章 犬穿透性角膜移植术后外周血清TNF-α的动态变化
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 犬穿透性角膜移植术后的眼部表现
• 2.2 受体犬外周血清TNF-α放免测定结果
• 3 讨论
• 3.1 穿透性角膜移植术后的排斥反应
• 3.2 受体犬外周血清TNF-α含量的动态变化
• 参考文献
• 第八章 犬穿透性角膜移植术后外周血清IL-2的动态变化
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 犬穿透性角膜移植术后的眼部表现
• 2.2 受体犬外周血清IL-2放免测定结果
• 3 讨论
• 3.1 穿透性角膜移植术后的炎症反应
• 3.2 受体犬外周血清IL-2含量的动态变化
• 参考文献
• 第九章 犬穿透性角膜移植术后外周血清β-EP的动态变化
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 犬穿透性角膜移植实验结果
• 2.2 受体犬外周血清β-EP放免测定结果
• 3 讨论
• 3.1 穿透性角膜移植术后的疼痛反应
• 3.2 受体犬外周血清B-EP含量的动态变化
• 参考文献
• 第十章 犬穿透性角膜移植术后角膜病理组织学观察
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 犬穿透性角膜移植结果
• 2.2 犬角膜病理组织学观察结果
• 3 讨论
• 3.1 穿透性角膜移植术后植片的观察方法
• 3.2 实验犬术眼角膜组织的病理学变化
• 参考文献
• 第十一章 DLA-DRB1基因配型对犬穿透性角膜移植的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 犬穿透性角膜移植结果
• 2.2 DLA-DRB1基因扩增产物测序及同源性分析结果
• 3.讨论
• 3.1 关于角膜移植的组织分型、配型技术
• 3.2 实验犬DLA-DRB1基因序列同源性对角膜移植的影响
• 参考文献
• 全文结论
• 本文的创新之处
• 图片及说明
• 致谢
• 附录一
• 附录二