论文摘要
前言各种原因所致的急慢性肝功能衰竭，因其病情危重，进展迅速，病死率高，是临床亟待解决的治疗性难题。白人工肝支持系统（artificial liver support system，ALSS）被用于治疗各种急性肝功能衰竭，已取得非常好的疗效。但是，由于非生物型人工肝缺乏肝细胞的代谢、生物转化等功能。然而生物型人工肝（bioartificial liver，BAL）依赖于生物反应器中的肝细胞发挥着肝细胞的氨代谢和生物转化等重要作用，可以弥补非生物型人工肝的上述缺陷，因此，近年来，以肝细胞为基础的生物型人工肝是目前人工肝治疗肝衰竭的研究热点，不同类型的BAL不断出现，迄今4种BAL系统业已开始进行Ⅱ—Ⅲ期临床验证，譬如HepatAssist、ELAD等。初步结果证明这些BAL治疗是安全、有效的，没有明显的不良事件出现。由于供肝的短缺，生物型人工肝的发展亦面临着困难。然而，由于猪肝细胞的代谢功能与人肝细胞最为接近，目前大多数基础和临床研究均采用原代猪肝细胞作为肝细胞源。但是，由于原代肝细胞在体外培养时均存在生长条件要求严格、存活时间及产量有限、难以传代等问题，这样就限制了生物型人工肝的发展。采用永生化技术建立永生化肝细胞，是解决生物型人工肝细胞来源的重要途径之一，可为生物型人工肝治疗肝衰竭提供大量的肝细胞成为可能。本实验采用逆转录病毒载体的方法将SV40大T抗原（SV40 LT）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）导入到原代猪肝细胞，建立永生化猪肝细胞系。将为生物型人工肝系统体外评价、细胞移植、体外药物代谢模型等提供了理想的肝细胞源。材料与方法首先分子克隆技术分别构建含人端粒酶逆转录酶、SV40大T抗原重组逆转录病毒载体；用磷酸钙沉淀法分别将hTERT／pLPCX和SV40 LT／pLXSN转染至对数生长期的PT67细胞，经嘌呤霉素、G418药物压力筛选，建立两株产毒细胞株，并测定两种细胞上清的病毒滴度。其次，用含SV40大T抗原的重组逆转录病毒上清感染原代猪肝细胞，G418药物进行压力筛选获得细胞克隆；接着，用含人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒上清感染细胞克隆，经嘌呤霉素筛选，建立永生化猪肝细胞。最后，采用倒置显微镜、电镜观察细胞形态；Western blot法检测永生化猪肝细胞中端粒酶和SV40大T抗原的表达；RT-PCR检测永生化猪肝细胞HepLP的ALB mRNA的表达；细胞增殖实验绘制细胞生长曲线；生化仪检测细胞上清的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）等指标；ELISA双抗体夹心法检测细胞上清的猪白蛋白；裸鼠致瘤性实验观察其有无肿瘤形成、以及进行细胞染色体核型分析。结果成功的构建了hTERT／pLPCX和SV40 LT／pLXSN重组逆转录病毒载体，获得产生含hTERT、SV40 LT重组逆转录病毒的两种细胞株。用含SV40大T抗原、人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒感染原代猪肝细胞，并经过筛选后获得三个耐嘌呤霉素和G418药物的永生化猪肝细胞克隆；并传代60代以上。并对其中一个命名为HepLP的永生化猪肝细胞进行鉴定。该细胞均为单层贴壁生长，肝细胞的形态呈椭圆形、典型的上皮细胞样特征。在透射电子显微镜下，所获得的猪肝细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞内丰富的糖原颗粒和大量的线粒体以及内质网结构清晰可见；在扫描电子显微镜下，永生化猪肝细胞的表面可见典型的微状突起物。永生化猪肝细胞呈典型的“S”型生长。永生化猪肝细胞的染色体数目为38（2倍体）。用Western bllot检测该细胞的蛋白，在120KD处出现一条阳性带，表明该细胞系表达端粒酶；在93KD处出现条带，表明该细胞系也表达SV40大T抗原。以原代猪肝细胞为阳性对照，一步法RT-PCR扩增检测结果显示：第6代，第22代，47代的永生化猪肝细胞HepLP和原代猪肝细胞在270 bp处均出现DNA条带，表明该永生化猪肝细胞具有表达ALB mRNA的等肝细胞基本生物学功能。在永生化猪肝细胞的培养上清中均可检测到谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、尿素氮（BUN）的分泌。采用ELISA双抗体夹心法可检测到永生化猪肝细胞培养上清的特异性猪白蛋白的分泌。裸鼠致瘤性试验显示注射永生化猪肝细胞的裸鼠6个月后仍没有观察到肿瘤。结论1．构建了hTERT／pLPCX和SV40 LT／pLXSN重组逆转录病毒载体。2．建立了含hTERT基因、SV40 LT基因的重组逆转录病毒的两种产毒细胞株。3．创建了永生化猪肝细胞的制备方法，并申请发明专利。将为人源性肝细胞、肝非实质细胞等其他细胞的永生化提供了新的方法。4．建立了的永生化猪肝细胞系，该细胞系具有正常猪肝细胞的生物学特性，已经传代60多代；裸鼠实验显示无致瘤性的。将为生物型人工肝前系统评价提供了理想的肝细胞来源，可为细胞移植、体外药物筛选等提供了良好的细胞模型。
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