猪圆环病毒2的免疫原性研究

论文摘要

本研究利用我们从浙江“猪高热综合征”病例分离的PCV2毒株进行了致病力测定。结果显示感染猪的生长明显迟缓。所有猪均能从组织中分离到接种的病毒。不同剂量的病毒接种35日龄仔猪后,在感染后10～14天出现了明显的持续性体温升高。组织和血清中的病毒载量显示,所有组织均可检测到PCV2特异性核酸,其中以腹股沟淋巴结含毒量最高；感染后3-35天均可从感染猪血清中检测PCV2特异性核酸,感染后14天达到高峰。排毒试验结果显示,所有感染猪均能从鼻肛拭子中检测到PCV2特异性核酸。严重的病理性损伤主要发生在肺脏、脾脏、腹股沟淋巴结和肺门淋巴结。不同剂量的病毒接种后,所有被检测的指标以5×10-7TCID50/ml剂量接种猪最显著。在PCV2致病力模型建立后,选用ZJ-U毒株为疫苗株,我们进行了免疫原性研究。结果显示,当病毒用不同浓度的灭活剂X进行灭活时,1：2000稀释的灭活剂X能在48h内完全灭活病毒。选用两种不同的佐剂1和佐剂2制作不相同的两种疫苗进行免疫试验,免疫后14天,佐剂1和佐剂2组均有37.5%的猪ELISA抗体阳转。病毒血症检测显示,免疫组攻毒后14天未能在血清中检测到PCV2核酸,而攻毒对照组能检测到高拷贝的PCV2核酸。组织病毒载量检测显示,免疫组攻毒后14天仅在个别猪检测到低滴度的PCV2核酸,而对照攻毒组的所有猪均能检测到较高滴度的PCV2核酸。病毒再分离显示,免疫后攻毒组部分猪的腹股沟淋巴结在盲传3代后能检测到病毒,但对照攻毒猪在细胞培养第1代即能分离到病毒。病理组织学分析显示,与健康攻毒组比较,免疫攻毒猪未出现明显的病理学损伤。排毒试验检测显示,免疫攻毒组偶有排毒现象,而对照组则是持续排毒。这些数据说明,制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性。与佐剂1相比,佐剂2制备的疫苗效果更优。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 研究的目的意义与技术路线
• 试验研究的技术路线
• 第一部分 文献综述
• 前言
• 1.病原学
• 1.1 PCV2的发现
• 1.2 PCV2的分类地位
• 1.3 PCV2的形态学、理化及培养特性
• 1.4 PCV2的分子生物学特征
• 1.5 编码的蛋白
• 1.5.1 Rep蛋白
• 1.5.2 Cap蛋白
• 1.5.3 ORF3蛋白
• 1.5.4 其他ORFs编码蛋白
• 1.6 PCV2的培养特性
• 1.7 PCV2的复制
• 1.8 PCV2毒株的遗传进化
• 2.流行病学
• 2.1 易感动物
• 2.2 传播方式
• 2.3 流行情况
• 3.PCV2的致病机理
• 3.1 感染PCV2后猪体内的相关变化
• 3.2 各种因素对PCV2感染的影响
• 3.2.1 其他病原对疾病发展的促进和诱导
• 3.2.2 免疫刺激的作用
• 4.与PCV2相关的疾病
• 4.1 断奶后仔猪多系统衰竭综合症
• 4.2 猪肾病与皮炎综合症
• 4.3 母猪繁殖障碍
• 5. PCVD相关疫苗
• 5.1 PCV2疫苗应用现状
• 5.2 全病毒灭活苗
• 5.3 亚单位疫苗
• 5.4 嵌合病毒灭活苗
• 5.5 免疫接种的方法
• 第二部分 研究内容
• 第一章 猪圆环病毒2感染模型的建立
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 毒株
• 1.2 实验猪
• 1.3 试剂与耗材
• 1.4 主要仪器及设备
• 2 方法
• 2.1 病毒的大量培养和浓缩
• 2.1.1 病毒的培养
• 2.1.1.1 细胞培养
• 2.1.1.2 接毒
• 2.1.1.3 收毒
• 2.1.2 病毒的浓缩
• 50的测定'>2.2 TCID₅₀的测定
• 2.3 动物的分组设计与实验感染
• 2.4 临床指标观察
• 2.4.1 采食量
• 2.4.2 体温
• 2.4.3 体重
• 2.5 临床样本收集
• 2.5.1 鼻拭子和肛拭子
• 2.5.2 血液样本采集
• 2.6 剖检与病料采集
• 2.7 测定PCV2抗体的IFA效价
• 2.7.1 病毒板的制作
• 2.7.2 IFA效价的测定
• 2.8 测定PCV2抗体的ELISA效价
• 2.9 组织病理切片
• 2.10 病毒核酸的检测
• 2.10.1 病料中DNA的抽提
• 2.10.2 病毒全基因组的克隆
• 2.10.2.1 引物的设计
• 2.10.2.2 通过PCR扩增
• 2.10.2.3 PCR产物纯化
• 2.10.2.4 连接
• 2.10.2.5 转化
• 2.10.2.6 PCR质粒抽提
• 2.10.2.7 PCR验证
• 2.11 病毒的再分离
• 2.12 PCV2核酸的荧光定量PCR（qPCR）
• 2.12.1 荧光定量PCR引物的设计与合成
• 2.12.2 荧光PCR的反应体系与程序
• 2.12.3 数据处理
• 3. 结果
• 3.1 病毒效价的测定
• 3.2 感染猪采食量变化
• 3.3 体温动态变化
• 3.4 体重增长趋势
• 3.5 临床剖检病变
• 3.6 组织病理变化
• 3.7 感染猪病毒全基因测序与病毒的再分离
• 3.8 病毒在各个组织的分布及其载量
• 3.9 血清中病毒核酸的定量
• 3.10 攻毒猪的排毒
• 4.讨论
• 第二章 PCV2免疫原性研究
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒和佐剂
• 1.1.2 实验猪
• 1.1.3 试验动物背景
• 1.1.4 试剂与耗材
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 病毒抗原制备
• 50的测定'>1.2.2 病毒TCID₅₀的测定
• 1.2.3 抗原的浓缩
• 1.2.4 抗原的灭活
• 1.2.5 抗原灭活的安全性检测
• 1.2.6 疫苗的制备
• 1.2.7 动物免疫实验设计与强毒攻击
• 1.2.8 强毒攻击
• 1.2.9 临床指标观察
• 1.2.9.1 采食量
• 1.2.9.2 体温
• 1.2.9.3 体重
• 1.2.10 临床样本收集
• 1.2.10.1 鼻拭子和肛拭子
• 1.2.10.2 血液样本采集
• 1.2.11 剖检与病料采集
• 1.2.12 IFA效价测定
• 1.2.13 ELISA抗体效价测定
• 1.2.14 组织病理切片
• 1.2.15 组织和血清中PCV2核酸的荧光定量PCR（qPCR）
• 1.2.16 排毒情况测定
• 2 结果
• 2.1 病毒抗原灭活安全性检测
• 2.2 采食量
• 2.3 体温动态变化
• 2.4 体重增长趋势
• 2.5 抗PCV2特异性抗体的检测
• 2.5.1 IFA效价的测定
• 2.5.2 ELISA抗体
• 2.5.3 中和抗体效价
• 2.6 病毒血症
• 2.7 攻毒猪的排毒
• 2.8 临床剖检病变
• 2.9 组织病理变化
• 2.10 病毒在各个组织的分布及其载量
• 2.11 病毒的再分离
• 3. 讨论
• 参考文献
• 附录一 常用缓冲液及培养基配方
• 附录二 攻读硕士期间研究成果
• 致谢