论文摘要
神经生长因子NGF（nerve growth factor）是神经营养素家族成员之一,该家族还包括BDNF,NT-3,NT-4/5,对于神经元的存活、生长、分化等具有重要的调节作用。NGF的效应受两类不同的细胞表面受体调控:受体酪氨酸激酶TrkA和p75神经营养素受体。NGF与TrkA结合后,可以促进TrkA发生二聚化和自磷酸化,激活与TrkA结合的下游信号分子,通过一系列的酶促级联反应,最终激活Ras-Raf-MAPK,PI-3K,PLCγ等信号传导通路,调控神经元的生长、分化、存活等生物学效应。TrkA属于受体酪氨酸激酶,分为胞外配体结合区,跨膜区和胞内的酪氨酸激酶区。胞内区含有多个接头蛋白的结合位点,如Shc、Grb2、SH2-B等,其中Y499、Y547、Y638、Y634等酪氨酸位点对于TrkA受体的激活及信号转导起关键作用。 Mint家族包括Mint1,Mira2和Mira3三个成员,是一类含有多个结构功能域的蛋白分子,三者除N端序列有所不同外,中间的PTB结构域和C端的2个PDZ结构域都具有很高的同源性。通过不同的结构域,Mint可以与不同的分子结合,如munc18-1、Cask、APP、NF-κB/p65、早老因子-1等,进而在突触囊泡递质的释放、β-淀粉样前体蛋白的代谢等方面起一定的调节作用。 本室在前期研究中,以TrkA胞内段为诱饵进行酵母双杂交筛选人脑cDNA文库,发现信号分子Mint2可以与之结合。在随后的研究中,利用免疫共沉淀和GST-PULL DOWN技术证实了Mint2和TrkA在脊髓和海马组织裂解液内存在结合。本研究拟运用免疫荧光标记等技术进一步确证Mint2和TrkA在神经元内的共定位,通过FRET技术检测两者在活细胞内的结合以及这种结合的配体依赖性,并进一步探索两者结合的功能意义。 本研究取得的结果如下: 1.利用特异性的Mint2抗体和TrkA抗体标记脊髓组织切片和体外培养的海马神经元,发现Mint2和TrkA在脊髓前、后角的神经元和海马神经元内均有共存,两者的共存部位主要集中在胞浆和部分突起中。 2.构建ECFP-Mint2和EYFP-TrkA融合蛋白表达质粒,瞬时共转染PCI2细胞,发现EYFP-TrkA和ECFP-Mint2在胞浆内有共定位,所得结果与内源性