苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518新型杀线虫晶体蛋白基因分离的新策略

论文摘要

本研究建立了一种克隆苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因的新方法。该方法的主要步骤为,先以一种苏云金芽胞杆菌无质粒无晶体突变株为宿主菌,利用穿梭载体,构建野生型苏云金芽胞杆菌菌株的质粒DNA文库,然后通过显微镜观察和SDS-PAGE检测的方法筛出选能够形成晶体的菌株。通过这种方法,本研究从苏云金芽胞杆菌野生型菌株YBT-1518中筛选到了三个晶体蛋白基因——cry55Aa1、cry6Aa2和cry5Ba2。菌株YBT-1518为我室分离的对北方根结线虫有高毒力的菌株。该菌株能够在其芽胞期产生长米粒状的晶体;晶体的成分通过SDS-PAGE检测主要由45 kDa和54 kDa的蛋白组成。45 kDa的蛋白的编码基因cry55Aa1与任何已知的cry基因之间都没有相似性,为一种新的杀虫晶体蛋白基因。该基因能够在苏云金芽胞杆菌无质粒无晶体突变株BMB171中独立表达并且累积形成与出发菌株YBT-1518相同的长米粒状的伴胞晶体;基因cry5Ba2在宿主BMB171中同样可以独立表达,但其产生的晶体则为菱形,SDS-PAGE检测显示其主要成分为140 kDa的蛋白。研究表明,在菌株YBT-1518中从来没有观察到过菱形的晶体或者140 kDa的晶体蛋白,这就说明晶体蛋白基因cry5Ba2在其出发菌株的表型是隐蔽的。生物测定表明,这三种晶体蛋白对北方根结线虫都有活性。研究表明,在菌株YBT-1518中,基因cry55Aa1和cry6Aa2均定位于该菌中可检测到的最小的质粒上。该质粒被命名为pBMB0228。测序结果显示,质粒pBMB0228全长17,732 bp,G+C%为29.5%。该质粒编码有前面提到的两种晶体蛋白基因——cry55Aa1和cry6Aa2,同时还编码有Cry6A类蛋白基因cry6A-like和cry6Aa2的负调控因子R2蛋白类似蛋白的编码基因R2-like。此外,该质粒还编码两种类型的Rep蛋白——类似于Rep14-3的Rep0228和类似于RepL的RepL0228以及两种相互之间相性很高的Mob蛋白——Mob02281和Mob02282,这两种Mob蛋白的氨基酸序列之间的相似性的identity为86%。质粒pBMB0228的功能验证实验表明,该质粒上存在的两种Rep蛋白在异源宿主BMB171中都能行使复制起始功能;该质粒编码的两种Mob蛋白在自主转移质粒pAW63∶∶Tn5401的帮助下能够发生转移,其转移频率接近于质粒pBMBt1、pGI2和质粒pTX14-3等质粒的转移频率。基因cry5Ba2在菌株YBT-1518中隐蔽机制的初步研究表明,该菌株中Cry55Aa1和Cry6Aa2的高量表达不是该基因隐蔽表型的关键因素;距该基因上游最近的两个读码框以及下游临近的一个读码框对该基因的隐蔽表型也不起关键作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 植物根结线虫生物防治研究进展
• 1.1.1 植物根结线虫概述
• 1.1.2 植物根结线虫的生物防治
• 1.1.3 苏云金芽胞杆菌防治植物寄生线虫的研究进展
• 1.2 苏云金芽胞杆菌及其杀虫晶体蛋白
• 1.2.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因
• 1.3 质粒
• 1.3.1 质粒的拷贝数
• 1.3.2 质粒的复制
• 1.3.3 质粒复制的调节
• 1.3.4 质粒的不相容性
• 1.3.5 质粒的稳定性
• 1.3.6 质粒的转移
• 1.4 苏云金芽胞杆菌质粒研究进展
• 1.4.1 苏云金芽胞杆菌质粒的分类
• 1.4.2 苏云金芽胞杆菌质粒的功能研究
• 1.4.3 苏云金芽胞杆菌质粒基因组的研究
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试剂和仪器
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 菌株和材料
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 本研究所用培养基配方
• 2.3 细菌质粒的制备和DNA操作
• 2.3.1 苏云金芽胞杆菌质粒的提取
• 2.3.2 大肠杆菌质粒的提取
• 2.3.3 质粒DNA的纯化和脱盐
• 2.3.4 PCR扩增
• 2.3.5 其它DNA操作
• 2.4 转化
• 2.4.1 大肠杆菌的电转化
• 2.4.2 苏云金芽胞杆菌的电转化
• 2.5 显微镜观察
• 2.6 Southern杂交
• 2.6.1 转膜
• 2.6.2 杂交
• 2.6.3 斑点杂交
• 2.7 晶体蛋白的纯化和SDS-PAGE检测
• 2.7.1 SDS-PAGE样品的制备
• 2.7.2 晶体蛋白的纯化
• 2.7.3 晶体蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.8 Western blot
• 2.8.1 抗体的制备
• 2.8.2 Western blot
• 2.9 序列分析
• 2.9.1 DNA的测序和序列分析
• 2.9.2 蛋白序列的分析
• 2.10 苏云金芽胞杆菌BAC文库的构建
• 2.10.1 BAC载体的制备
• 2.10.2 苏云金芽胞杆菌大片段DNA的制备
• 2.10.3 转化和文库的保存
• 2.11 根结线虫生物活性的测定
• 2.12 苏云金芽胞杆菌质粒稳定性检测
• 2.13 质粒的接合转移
• 3 结果和分析
• 3.1 杀线虫晶体蛋白基因cry55Aa1、cry6Aa2以及cry5Ba2的克隆
• 3.1.1 苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518总DNA的BAC文库的构建
• 3.1.2 苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518质粒DNA文库的构建
• 3.1.3 能够产生晶体的重组子的筛选
• 3.1.4 晶体蛋白基因cry55Aa1、cry6Aa2以及cry5Ba2的分离
• 3.1.5 晶体蛋白基因cry55Aa1和cry6Aa2的定位
• 3.1.6 晶体蛋白对北方根结线虫的生物活性测定
• 3.1.7 小结
• 3.2 质粒pBMB0228的序列分析
• 3.2.1 质粒pBMB0228的注释
• 3.2.2 Cry蛋白以及Cry类似编码序列的分析
• 3.2.3 复制区序列解析
• 3.2.4 接合转移功能相关序列分析
• 3.2.5 IS序列分析
• 3.2.6 小结
• 3.3 质粒pBMB0228的功能验证
• 3.3.1 基因cry55Aa1和cry6Aa2在菌株BMB171中的共表达
• 3.3.2 复制蛋白功能验证
• 3.3.3 重组质粒稳定性的检测
• 3.3.4 Mob蛋白功能验证
• 3.3.5 Cry6A-like以及R2-like蛋白形成晶体情况的检测
• 3.3.6 小结
• 3.4 基因cry5Ba2在菌株YBT-1518中隐蔽机制的初步研究
• 3.4.1 Cry5Ba2蛋白在菌株YBT-1518的Western blot检测
• 3.4.2 基因cry5Ba2在菌株YBT-1518中的定位
• 3.4.3 晶体蛋白基因cry55Aa1和cry6Aa2的表达对基因cry5Ba2的影响
• 3.4.4 基因cry5Ba2的侧翼序列对其表达的影响
• 3.4.5 小结
• 3.5 几株苏云金芽胞杆菌BAC文库的构建
• 4 讨论
• 5 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 本研究所用工具载体的物理图谱
• 附录B 发表论文和申请专利