新型逆流色谱技术及其在天然生物活性成分研究中的应用

论文摘要

逆流色谱（CCC）是一种不用固相支持体的液-液分配色谱技术。它具有分离量大、回收率高、分离环境缓和、节省溶剂等优点,已在天然来源有效成分的分离纯化中显示出独特的优势。本论文以复杂天然产物粗提物为研究对象,针对现有方法和技术的不足,发展并建立了几种新型逆流色谱技术,并成功应用于天然来源生物活性成分的快速分离分析,具体研究内容包括以下几个部分：第一部分应用立式逆流色谱（UCCC）,建立了从传统药用植物姜、冬凌草和厚朴中制备性分离其主要有效成分的逆流色谱方法。利用该方法,从600毫克姜提取物中一步制备分离了150毫克（E）-4-（3’,4’-dimethoxyphenyl）but-3-enyl acetate和175毫克（E）-4-（3’,4’-dimethoxyphenyl）but-1,3-diene,纯度分别为98.7%和95.1%；从200毫克冬凌草甲素粗品中分离制备了纯度达97.8%的冬凌草甲素120毫克。此外,还成功的从2克厚朴提取物中制备分离了位置异构体厚朴酚与和厚朴酚,并与半制备型高效液相色谱进行了对比研究。第二部分发展了一种“中心切割”式逆流色谱联用系统。它采用上述立式逆流色谱仪（UCCC, Vc=1600 mL）作为第一维,一台半制备型Ito-IV逆流色谱仪（HSCCC, Vc=140 mL）作为第二维,并通过自行设计的阀切换系统进行在线连接。应用该“中心切割”式逆流色谱联用系统,成功地从印尼药用植物Artocorpus altilis提取物中一步分离制备了三种主要黄酮类成分。此外,通过改变联用方式,即以HSCCC作为第一维,以UCCC作为第二维,有效的解决了逆流色谱联用系统中的大体积进样问题。采用两种不同比例的两相溶剂体系及连续进样方式,一次性分离制备了冬凌草乙醇提取物中的冬凌草甲素和冬凌草乙素。结果表明,该联用系统可以有效提高逆流色谱的分辨能力和峰容量,提高分离效率。第三部分发展并建立了反推逆流色谱方法及其理论。该方法充分利用了液体固定相的特点,在不改变流动相的条件下切换流向,使柱中不相溶两相体系的流体动力学平衡迅速瓦解,而具有高保留值的分析物则随着色谱固定相被“推出”色谱柱。利用一组标准混合物对反推逆流色谱方法及理论进行了系统研究和验证。此外,还成功应用该方法对两种天然产物粗提物荜茇和吴茱萸中的化学成分进行了快速分离分析,并与先前建立的洗脱-推出方法做了对比研究。结果显示反推逆流色谱方法充分拓展了逆流色谱的极性适用区间,非常适合天然产物提取物等复杂样品的快速制备性分离。第四部分设计并研制了一台分析型三柱并联逆流色谱仪,并结合Arizona溶剂系统与洗脱-推出方法,建立了一种高通量的两相溶剂体系筛选方案。对于一给定复杂样品只需花半天时间使用少于一升的溶剂就可以确定其最佳的两相溶剂体系组成。该方法成功应用于两种天然产物粗提物荜茇和虎杖中活性成分的快速筛选。结合抗氧化活性检测以及液质联用分析,快速确定了虎杖提取物中的潜在抗氧化活性成分。结果显示该高通量逆流色谱方法非常适合复杂天然产物的快速分离分析,在新型天然药物先导化合物的筛选中具有很好的应用前景。此外,论文还就逆流色谱技术的工作原理及其应用进展进行了简要的总结。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 逆流色谱综述
• 1.1 逆流色谱简介
• 1.2 逆流色谱基本原理
• 1.3 逆流色谱溶剂体系选择
• 1.4 逆流色谱研究进展
• 1.4.1 逆流色谱在分离天然产物中的应用
• 1.4.2 pH区带精制逆流色谱
• 1.4.3 逆流色谱在生物分离中的应用
• 1.4.4 逆流色谱在手性分离中的应用
• 1.5 本章小结
• 第2章 应用立式逆流色谱分离纯化天然产物有效成分
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 立式逆流色谱仪
• D）测定'>2.2.3 分配系数（K_D）测定
• 2.2.4 两相溶剂体系以及样品溶液的制备
• 2.2.5 CCC分离步骤
• 2.2.6 高效液相色谱分析
• 2.2.7 结构分析和鉴定
• 2.3 应用立式逆流色谱分离纯化Zingiber cassumunar中有效成分
• 2.3.1 Zingiber cassumunar
• 2.3.2 植物粗提物制备
• 2.3.3 植物粗提物HPLC分析
• 2.3.4 两相溶剂体系选择
• 2.3.5 立式逆流色谱分离结果
• 2.3.6 化合物的结构鉴定
• 2.4 应用立式逆流色谱分离纯化冬凌草中冬凌草甲素
• 2.4.1 冬凌草
• 2.4.2 植物粗提物制备
• 2.4.3 植物粗提物HPLC分析
• 2.4.4 两相溶剂体系选择
• 2.4.5 立式逆流色谱分离结果
• 2.4.6 化合物的结构鉴定
• 2.5 应用立式逆流色谱分离纯化厚朴中的厚朴酚与和厚朴酚
• 2.5.1 厚朴
• 2.5.2 厚朴提取物HPLC分析
• 2.5.3 两相溶剂体系选择
• 2.5.4 固定相保留值的研究
• 2.5.5 立式逆流色谱分离结果
• 2.5.6 立式逆流色谱与半制备HPLC的比较研究
• 2.5.7 化合物的结构鉴定
• 2.6 本章小结
• 第3章 逆流色谱联用系统及其应用
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 逆流色谱仪
• 3.2.3 样品制备
• 3.2.4 两相溶剂体系以及样品溶液的制备
• 3.2.5 高效液相色谱分析
• 3.2.6 结构分析和鉴定
• 3.3 "中心切割"式逆流色谱联用系统分离纯化Artocorpus altilis中有效成分
• 3.3.1 Artocorpus altilis
• 3.3.2 植物粗提物HPLC分析
• 3.3.3 两相溶剂体系选择
• 3.3.4 "中心切割"式逆流色谱联用系统
• 3.3.5 逆流色谱联用系统分离结果
• 3.3.6 化合物结构鉴定
• 3.4 逆流色谱联用系统高效分离冬凌草提取物中的甲素和乙素
• 3.4.1 冬凌草乙醇提取物HPLC分析
• 3.4.2 两相溶剂体系选择
• 3.4.3 改进的逆流色谱联用系统
• 3.4.4 逆流色谱联用系统分离结果
• 3.4.5 化合物结构鉴定
• 3.5 本章小结
• 第4章 反推逆流色谱理论及其应用
• 4.1 引言
• 4.2 反推逆流色谱方法简介
• 4.2.1 液体固定相特性
• 4.2.2 反推逆流色谱
• 4.3 反推逆流色谱方法理论基础
• 4.3.1 色谱峰的保留
• 4.3.2 峰宽以及谱带展宽
• 4.4 实验部分
• 4.4.1 实验试剂
• 4.4.2 样品制备
• 4.4.3 逆流色谱
• 4.4.4 高效液相色谱
• 4.4.5 液质联用分析
• 4.5 反推逆流色谱方法的应用
• 4.5.1 应用标准混合物验证BECCC方法及理论
• 4.5.2 BECCC快速分离荜茇和吴茱萸提取物
• 4.5.3 BECCC和EECCC的对比研究
• 4.6 本章小结
• 第5章 天然活性物质的高通量逆流色谱筛选方法
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 实验试剂
• 5.2.2 仪器
• 5.2.3 天然产物粗提物的制备
• c EECCC）'>5.2.4 两柱体积洗脱-推出逆流色谱法（2V_cEECCC）
• 5.2.5 HPLC-UV-MS分析
• 5.2.6 DPPH抗氧化活性检测
• 5.2.7 活性化合物的结构鉴定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 Arizona溶剂体系
• 5.3.2 Arizona溶剂体系与分配系数的关系
• 5.3.3 高通量Arizona溶剂体系筛选策略
• c EECCC高通量筛选'>5.3.4 复杂天然提取物的2V_cEECCC高通量筛选
• 5.3.5 抗氧化活性指导的LC-UV-MS分析
• 5.3.6 目标化合物纯化及生物活性确认
• 5.4 本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读博士学位期间主要的研究成果
• 致谢