人类肝脏氧化应激反应和氧化还原调控网络的初步研究

论文摘要

肝脏作为人体的代谢中心，其旺盛的代谢活动必然会伴随ROS(reactive oxygen species)的大量生成，ROS的大量产生和／或抗氧化防御机制的不足将引起氧化应激，另外，酒精、药物、肥胖引起的过量自由脂肪酸代谢等都极易使肝细胞产生氧化应激，最终引发肝损伤及肝病。因此，各种氧化应激反应信号通路及氧化还原调控蛋白在保护肝脏免受氧化损伤中发挥重要的作用，但这些蛋白在肝脏中的作用及其作用机制尚无系统性研究。 规模化蛋白质相互作用研究是揭示蛋白质的作用机制，发现新的蛋白质功能、新的调控途径以及不同调控途径间内在联系等的重要手段。本文以肝脏氧化应激和氧化还原调控关键蛋白为诱饵，采用高通量酵母双杂交技术筛选人肝脏cDNA文库，从蛋白质相互作用角度出发，对肝脏氧化应激反应和氧化还原调控网络进行初步研究。 本文成功进行了27个诱饵的文库筛选，获得528个候选阳性克隆，除去非编码序列和不符合读框的序列，得到223条读框正确的猎物序列，相对于97对、涉及20个诱饵的相互作用。除11对已知相互作用外，其余为新发现的相互作用，提示在肝脏氧化应激反应和氧化还原调控网络中可能还有很多的成员未被发现。 为了进一步考察得到的相互作用的可靠性，我们首先对其技术假阳性和生物学假阳性进行评价。采用酵母回转验证实验对技术假阳性进行了初步评价，在随机挑选的61对相互作用中，回转阳性率为52.5％，而已知相互作用的回转阳性率也仅为53.3％。表明我们的数据中存在一定的假阳性，同时在回转验证中存在明显的假阴性，提示我们不能轻易地去除回转呈阴性的相互作用。对技术假阳性的有效评价还需要借助其它实验手段。 在生物学假阳性评价方面，我们采用多种生物信息分析方法，包括PubMed和HPRD数据库搜索、整合转录组和基因敲除表型数据、GO注释、相互作用结构域分析、模式生物同源性比较等。发现我们得到的相互作用中，有22对相互作用(23％)的诱饵和猎物基因名共同出现在相应文献中；26对相互作用(27％)的诱饵和猎物基因表达相关；9对相互作用(9％)的诱饵和猎物有相同或相

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要英文缩略词
• 目录
• 前言
• 第一章 用氧化应激反应和氧化还原调控相关蛋白筛选人肝脏cDNA文库
• 一、材料和方法
• 1. 材料
• 2. 方法
• 二、结果
• 1. 文库鉴定及其扩增
• 2. 诱饵载体的构建
• 3. 诱饵自激活检测
• 4. Y2H筛库
• 5. 相互作用的初步分析
• 三、讨论
• 第二章 相互作用数据的评价
• 一、材料和方法
• 1. 酵母回转验证
• 2. 生物信息学分析方法
• 二、结果
• 1. 酵母回转验证
• 2. 生物信息分析结果
• 2.1 已知相互作用的判定
• 2.2 与表达谱及基因敲除表型数据的整合
• 2.3 GO注释
• 2.4 相互作用结构域
• 2.5 模式生物同源性比较
• 3. 相互作用数据的整体评价
• 三、讨论
• 一、技术策略与方法
• 1. LCI数据的产生
• 2. 网络的构建
• 3. 相互作用数据的挖掘
• 二、相互作用网络的构建
• 1. LCI相互作用网络
• 2. Y2H相互作用网络
• 3. 整合 LCI和 Y2H相互作用的网络
• 三、相互作用数据的挖掘
• 1. 潜在的信号通路间的交联——Keap1-p65的相互作用
• 2. 揭示重要蛋白的作用机制——Keap1-Nrf1的相互作用
• 3. 揭示新蛋白的重要功能——Trx2-THAP1、Trx2-GASP2和Keap1-TSC22D4的相互作用
• 4. 揭示已知相互作用的其它重要功能——PRDX2-JAB1的相互作用
• 5. 发现重要蛋白复合物——PRDXs复合物
• 结论
• 存在问题和展望
• 参考文献
• 附录1: 诱饵基因引物和酵母菌落 PCR鉴定引物
• 附录2: 已知相互作用 LCI
• 附录3: 基因敲除表型
• 在读期间发表或投稿的论文
• 致谢