A型肉毒毒素（BoNT/A）表位多肽单克隆抗体的制备及其效价评定

论文摘要

一、研究背景和目的肉毒梭菌（Clostridium botulinum）是一种厌氧的、革兰氏阳性的孢子形成菌,肉毒毒素（botulinum neurotoxin,BoNT）是由肉毒梭菌分泌的一种神经毒素,是所发现的生物毒素和化学毒素中毒性最强的物质,它可以作用于周围运动神经末梢,神经肌肉接点即突触处,抑制突触前膜释放神经介质-乙酰胆碱,从而引起肌肉松驰性麻痹[1]。食品污染、婴儿肠道感染及伤口感染是引起人类肉毒毒素中毒的主要原因[2]。肉毒毒素共包含A-G七种血清型,A、B型是人类肉毒中毒的常见型别,E、F型偶尔引起食物中毒流行,C、D型则仅引起动物中毒,G型极少见。各型肉毒毒素分子在结构和功能上有很多相似的特点：均由重链（H链,相对分子质量为100KD）和轻链（L链,相对分子质量为50KD）组成,二者由1个二硫键连接。重链的羧基末端（Hc）,又称为受体结合区,它负责与靶细胞的结合；重链N端（HN结构域）为一个跨膜转运功能区域,而轻链具有锌离子肽链内切酶活性。结合、转运和催化这3个功能区域呈线性排列,转运区域位于中间[3]。催化区域为由α-螺旋和β-折叠组成的紧实的球形结构,转运区域主要由α-螺旋组成,结合区由两个亚单位组成。肉毒梭菌最初产生的毒素是无活性的单肽链,相对分子质量为150KD,随后经细菌本身的内源蛋白酶作用分解为两条链（H链和L链）,从而激活其活性。单链神经毒素转化为双链,提高了毒素的毒力。但产E型肉毒毒素的肉毒梭菌缺少内源蛋白酶,因而E型肉毒毒素是以单链形式存在的,只有在被宿主组织吸收后,在宿主蛋白酶作用下单链毒素活性才能被激活。肉毒毒素的作用包括结合、定位和麻痹3个阶段[4]。一旦毒素与神经细胞受体或具内吞作用的间接受体结合后,抗体就不能中和毒素。毒素与受体结合后,内涵体的酸性发生变化,启动毒素转运区域构象发生变化,同时囊泡腔在囊泡膜质子泵ATP酶作用下酸化,暴露出一个疏水区域,在膜上产生一个离子通道,L链通过此通道进入胞液[5]。在胞内,毒素分解三种蛋白释放ACh,导致肌肉松弛或痉挛麻痹[6]。肉毒毒素是目前已知的毒性最强的细菌蛋白质[7],0.1-1μgA型肉毒毒素就能引起人肉毒中毒,甚至死亡。人类肉毒中毒主要有4种类型[8]：①食物性肉毒中毒；②婴儿肉毒中毒；③肉毒毒素吸入性中毒,如在实验室中曾发生过肉毒毒素吸入性中毒,这是一种潜在的借助空气传播的中毒方式,极有可能被恐怖主义分子利用或用于制造生物战剂；④创伤性肉毒中毒,类似于破伤风。一个单分子的肉毒毒素就能终止一个神经细胞的功能,通过抑制神经肌肉连接处乙酰胆碱的释放而产生作用[9],中毒严重者由于呼吸肌的麻痹导致呼吸衰竭而死亡[10]。由于其极强的毒性及易生产的特点,A型肉毒毒素被归为A类生物战剂[11],更被列为六个最主要的生物战剂之一。由于产生肉毒毒素的肉毒梭菌在自然界广泛存在及其芽孢对外界环境的坚强抵抗力,肉毒毒素中毒事件时有发生,引起严重的公共卫生问题。早在1817年,Justinus Kerner首先认识到,食物中所携带的某种毒素,能够导致人体骨骼肌和副交感神经功能麻痹。至1895年,Van Ermengem在一次暴发性食物中毒流行病学调查中,于食物与人体内均检出了革兰阳性、厌氧肉毒梭菌（Clostridium botulinum）,并将其定名为“肉毒病（botulism） "。在我国最早发现肉毒中毒是在建国以后的50年代,在新疆自治区的察布查尔锡伯族自治县常爆发原因不明的一种被称之为“察布查尔病”的流行病而引起政府的注意。1958年,吴朝仁教授组成的调查组赴当地进行调查,根据随访、临床观察及不完整的实验室检验结果,初步诊断该病为肉毒中毒,也表明中国可能早已有肉毒中毒发生[12]。此后,我国研制成功了肉毒中毒诊断试剂与治疗预防用抗毒血清,确证了“察布查尔病”为A型肉毒中毒。此外,在全国其它省区也陆续报道发现肉毒中毒病例,迄今至少已殃及20多个省区。新疆基本上都是A型,而其它省区除有少数A、E型外,均为B型。表明我国肉毒中毒的型别具有某种地域倾向性。在国外,A型肉毒毒素很可能已被数十个国家如前苏联和伊拉克用于制备生物武器,同时肉毒毒素很容易被恐怖分子利用,通过气溶胶散布肉毒毒素或用于污染食物和水源以制造生物恐怖（bioterrorism）[11]。炭疽邮件事件和9.11事件之后,随着国际恐怖主义活动的日益猖獗,人类面临肉毒毒素中毒威胁程度日益加重。早在1984年恐怖组织曾用BoNT污染罐装橘汁,导致美军两艘潜水艇和Bangor基地的63人中毒和50人死亡；在1991-1995年间日本奥姆真理教（the Japanese cult AumShinrikyo）曾多次试图释放肉毒毒素[1l]。另外,美军对发动沙漠风暴（Desert Storm,90/91）行动的580名军人进行类毒素疫苗（PBT）免疫接种用于预防肉毒毒素,以防止伊拉克释放肉毒毒素生物武器。到2002年共有8000名军队服役人员进行了PBT疫苗接种[13]。另外,对维护国家生物安全、参与反恐行动的工作人员也尝试进行了PBT疫苗接种[14]。肉毒毒素无论是作为生物武器,还是作为生物恐怖战剂,或者是偶尔肉毒中毒及突发事件,其潜在的危害不可估计。国家在制定防御策略时必须考虑肉毒毒素的预防和治疗问题。因此,进行肉毒毒素的防治研究无论是对国家生物安全、公共卫生安全及人民生命健康安全都具有重要现实意义和巨大社会价值。二、研究方法1.A型肉毒毒素重链C末端保护性抗原的制备（1）A型肉毒毒素重链C末端抗原表位的预测本研究的二级结构的预测方法是：在GenBank的蛋白质数据库搜索栏中输入A型肉毒毒素,选取含全基因蛋白质序列的检索项,确定重链所在区的蛋白序列作为预测的对象,利用DNASTAR软件,采用Gamier等方案,对蛋白序列作二级结构的预测。利用DNAStar Protean软件模块进行二级结构的预测,用Chou-Fasman法从氨基酸残基的晶体结构预测蛋白质的二级结构；用Garnier-Robson法计算特定氨基酸残基在特定结构内部的可能性：用Karplus-Schuhz法预测蛋白质骨架区的柔性。以7个氨基酸残基为一组的方案,用Kyte-Doolittle法预测蛋白质的疏水区和亲水区；用Emini原则预测特定区域位于蛋白质表面的可能性；应用亲水性、表面特性、柔性和二级结构4种参数联合的Jameson-Wolf法称为综合预测蛋白的抗原指数,根据其结果选取主要抗原域（Mainan-tigenic domains, MAD）。另外,还可采用吴玉章等研发的抗原性指数的预测方法或应用网络服务器(http://www.expasy.Org/cgi-bin/protscale来进行B细胞抗原表位的预测,根据BoNT/A氨基酸残基的亲水性、可及性、二级结构等参数,预测抗原表位的形成,在预测方案中遵循的原则是选择p转角和p折叠及无规卷曲易形成B细胞抗原表位的区域,作多参数预测。将上述方法互相参照,兼顾各种预测参数,在预测方案中遵循的原则是选择p转角和p折叠及无规卷曲等易形成抗原表位的区域,综合分析,推断A型肉毒毒素重链可能的抗原表位区。（2）A型肉毒毒素重链C末端抗原多肽的合成根据上述A型肉毒毒素重链C末端抗原表位的预测结果,让上海吉尔生化生物公司合成多肽。2.A型肉毒毒素重链C末端抗原多肽单克隆抗体的制备（1）小鼠免疫选取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠,首次免疫用0.5mg BoNT/A合成抗原与等量完全弗氏佐剂混匀（1ml抗原+1mlFCA）,乳化到滴水不化后做小鼠背部皮下多点注射,注射体积200μl/只小鼠。2周后,0.5mg BoNT/A合成抗原与等体积福氏不完全佐剂（1ml抗原+1mlFIA）混匀,乳化到滴水不化后做小鼠背部皮下多点注射,注射体积200μl/只小鼠。两周后,断尾采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）。两周后,0.5mg BoNT/A合成抗原与等体积福氏不完全佐剂（1ml抗原+1mlFIA）混匀,乳化到滴水不化后小鼠腹腔注射,注射体积200μl/只小鼠。两周后,断尾采小鼠尾静脉血分离血清用间接ELISA法检测抗血清抗体效价,若效价达到50万以上,则可进行腹腔注射等量抗原和PBS（不加佐剂）混合液,三天后采血测效价后做细胞融合。（2）细胞融合将培养处于对数生长的NS-1细胞和脾细胞用洗液作适当稀释后记数,两种细胞按1：4的比例混合,1200r/min离心12mmin,去上清,同样方法清洗细胞2次。用手掌心撞击离心管将离心管底部的细胞混匀。将融合管置于40℃水浴中,用1ml吸管将预热至40℃C的50%PEG（PH8.0）滴加到融合管中,边滴边轻轻转动融合管,90s内匀速加完。然后滴加3ml预热到37℃的完全培养基,1min内匀速加完。再滴加20ml预热至37℃的完全培养基,缓慢加入融合管中,完毕后用滴管轻轻吹打细胞,使细胞混匀（切忌吹打过猛）,将细胞悬液用完全培养基定容至40ml,轻轻混匀细胞。在铺有饲养细胞的96孔扳上加入2滴/孔的融合细胞悬液,最后将融合细胞培养板标记后放置于37℃,5%CO2培养箱中培养,融合后8小时补加HAT选择性培养基（HAT终浓度1×）。（3）细胞筛选融合后的细胞置37℃,5% CO2培养箱中培养。次日检查有无污染,第3d补1-2滴HAT培养基；一般5-6d可见小克隆；7d时出现克隆的孔内半径量换液,用50%HAT+50%HT换液,并取上清做ELISA测上清效价；8-10d待细胞生长到培养孔面积的1/3左右时可吸取少量的上清用于筛选,并用HT培养基换液,测上清的效价,挑选单个细胞团块的、效价较高的阳性孔作为目标克隆孔。用ELISA检测阳性克隆孔,对强阳性、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化。（4）克隆化采用有限稀释法对阳性孔的融合细胞团块进行克隆化。方法如下：克隆前用Balb/c小鼠制备饲养细胞,将阳性孔细胞吹打起,悬液在倒置显微镜下计数后,然后用含HAT的IMDM（含15%胎牛血清）调整细胞数。选A1、B1孔为保种孔,A1孔：从阳性孔中吸取100ul细胞悬液于A1孔中作为保种孔；B1孔：从A1孔中吸取10ul细胞悬液于B1孔中,混匀,在显微镜下用细胞计数板计数。然后从B1孔中吸取细胞悬液于10ml完全培养基中,细胞数量控制在1-1.5个/孔铺板,每孔100ul。置于37℃,5%C02的培养箱内培养,第二天观察细胞是否有污染。第5天起,每天观察各孔中的细胞团数,并对培养孔上清液进行ELISA检测,对单个克隆团块、效价较高的强阳性孔做扩大培养。再次克隆化,方法与初次基本相同,确保1-1.5个细胞/孔。（5）腹水的制备和效价的测定将阳性克隆孔内的细胞轻轻吹打下来,细胞计数板计数,置于0.5ml不完全IMDM培养液中,注入一周前预先注射过石蜡油或降植烷的小鼠腹腔内。2天后观察小鼠有无死亡或精神萎靡的症状,7天后,小鼠腹部明显膨胀,用16针管引流并收集腹水,将收集好的腹水10,000r/min离心3min,取上清。-20℃冻存腹水。间接ELISA方法测定,细胞培养上清与腹水分别从10倍和100倍开始做梯度稀释,同时以NS-1细胞培养上清做同样稀释浓度作为阳性对照。（6）单抗亚型的测定和纯化腹水mAb用包被液1：50000稀释后,进行免疫球蛋白亚类鉴定。以50-100μl/孔的量加入酶标板孔中,置4℃过夜或37℃吸附2小时。弃去孔内的液体,同时用PBST洗涤液洗3次,每次3-5分钟,用力拍干。每孔加200μl 5%脱脂奶粉7℃封闭2小时。洗涤液洗3次,每孔加50～100μl待检腹水mAb,同时设立未免疫小鼠血清为阴性对照及PBS为空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤,用力拍干。加酶标二抗体（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM）,每一种亚型做两个复孔,每孔50～100μl,37℃孵育1-2小时,洗涤,用力拍干。加底物液,A液：B液=1：1相混合,每孔加现配的底物显色液50～100μl,室温10分钟。以25μl-50μl的2mol/L H2SO4终止反应,在酶标仪上读取A45o值。结果判定：以P/N≥2.1,或P≥N+3D为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色,阳性对照孔明确显色,则可直接用肉眼观察结果。采用腹水纯化采用硫酸铵饱和法来纯化抗体,计算蛋白纯化率、蛋白纯度及蛋白绝对含量。三、结果1.A型肉毒毒素重链C末端抗原表位的预测本研究通过生物信息学手段进行B细胞抗原表位预测,建立基于表位预测的能够快速获得针对表位肽的特异性抗体的技术路线,筛选合成A型肉毒毒素HC端B细胞抗原表位多肽。根据A型肉毒毒素重链的一级结构,利用DNASTAR等分析软件,结合网络服务器,综合参考亲水性,可及性,柔韧性,及二级结构等多种参数预测B细胞抗原表位。最后预测出了两条抗原性较高的多肽：P1:（1164-1179AA）:KYASGNKDNIVRNNDR P2:1224-1238AA:KSKNDQGITNKCKMN2.A型肉毒毒素重链C末端抗原表位多肽的合成托上海吉尔生化有限公司合成A型肉毒毒素重链C末端抗原表位多肽P1和P2。经色谱分析仪分析,蛋白纯度在95%以上,规格为0.5mg/支。3.A型肉毒毒素重链C末端抗原单克隆抗体的制备和检测以A型肉毒毒素合成多肽（P1,P2）分别免疫Balb/C小鼠,制备单克隆抗体,经细胞融合、筛选、克隆后得到2株杂交瘤细胞,抽取小鼠腹水后鉴定抗体的蛋白亚型为IgG和IgM,并测定两株单抗的效价在10-5-10-6之间;经饱和硫酸铵纯化后检测抗体纯度,SDS-PAGE结果显示,抗体条带清晰,纯度较高；特异性反应鉴定抗体只与肉毒毒素反应,而不与葡萄球菌肠毒素等毒素反应,提示抗体特异性较好。四、讨论本研究通过生物信息学手段进行表位预测,建立基于表位预测快速获得针对表位肽的特异性抗体的技术路线,筛选A型肉毒毒素HC端B细胞抗原表位,并合成此多肽。根据A型肉毒毒素重链的一级结构,利用DNASTAR等分析软件,结合网络服务器,综合参考亲水性,可及性,柔韧性,及二级结构等多种参数预测B细胞抗原表位。最后预测出了两条抗原性较高的多肽。托上海吉尔生化有限公司合成A型肉毒毒素重链C末端抗原表位多肽P1和P2。经色谱分析仪分析,蛋白纯度在95%以上,蛋白纯度较高,利于后期BoNT/A单抗的制备。通过ELISA方法对蛋白进行抗原性鉴定,显示了较好的抗原性。以此多肽作为抗原成功的制备了A型肉毒毒素HC端B细胞抗原表位单克隆抗体并进行鉴定。以A型肉毒毒素HC端B细胞抗原表位合成多肽（P1,P2）分别免疫Balb/C小鼠,制备单克隆抗体,经细胞融合、筛选、克隆后得到2株杂交瘤细胞,抽取小鼠腹水后鉴定抗体的蛋白亚型为IgG和IgM,并测定两株单抗的效价在10-5～10-6之间；经饱和硫酸铵盐析法纯化后,检测抗体纯度,SDS-PAGE结果显示,抗体条带清晰,纯度在75%以上；特异性反应鉴定抗体只与A型肉毒毒素反应,而不与葡萄球菌肠毒素等毒素反应,提示抗体特异性较好。本研究为快速获得抗A型肉毒毒素的工程抗体提供新的思路,为今后获得高效价的抗体奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 研究目的和意义
• 2 肉毒毒素研究进展
• 2.1 毒素的来源和分布
• 2.2 肉毒毒素的理化性质和提取方法
• 2.3 肉毒毒素结构和作用方式
• 2.4 BoNT检测及预防
• 2.5 肉毒毒素中毒特点和预防
• 第一章 A型肉毒毒素重链C末端保护性抗原的制备
• 1.1 材料
• 1.1.1 网上GeneBank检索获得A型肉毒毒素的蛋白序列及三维立体结构
• 1.1.2 DNASTAR蛋白分析软件
• 1.1.3 B细胞表位优势区域的平均抗原性指数（AI）评分标准
• 1.1.4 网络服务器分析系统ExPasy系统
• 1.2 方法
• 1.2.1 A型肉毒毒素重链C末端抗原表位的预测
• 1.2.2 A型肉毒毒素重链C末端抗原多肽的合成
• 1.3 结果
• 1.3.1 A型肉毒毒素重链C末端抗原表位的预测
• 1.3.2 合成多肽的质谱分析结果
• 1.4 讨论
• 第二章 BoNT/A抗原表位单克隆抗体的制备与检测
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 细胞
• 2.1.4 培养基和缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 多肽合成抗原的制备
• 2.2.2 小鼠免疫
• 2.2.3 饲养细胞的制备
• 2.2.4 脾淋巴细胞的制备
• 2.2.5 髓瘤细胞的准备
• 2.2.6 细胞融合
• 2.2.7 融合细胞的培养
• 2.2.8 筛选（Screening）
• 2.2.9 克隆（Cloning）
• 2.2.10 体外扩大培养
• 2.2.11 细胞冻存
• 2.2.12 小鼠腹水制备
• 2.2.13 腹水抗体效价的测定
• 2.2.14 亚类鉴定
• 2.2.15 腹水抗体的纯化
• 2.2.16 抗体纯度的鉴定
• 2.2.17 蛋白绝对含量测定
• 2.2.18 抗体效价测定
• 2.2.19 抗体特异性检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 细胞融合
• 2.3.2 杂交瘤克隆化结果
• 2.3.3 单抗分型
• 2.3.4 抗体效价测定
• 2.3.5 单抗纯化结果
• 2.3.6 稳定性实验
• 2.3.7 抗体特异性检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 融合和阳性株筛选
• 2.4.2 关于单抗的纯化方法
• 2.4.3 肉毒毒素研究存在的问题
• 第三章 全文小结
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 硕士期间完成的论文
• 致谢