牛白血病病毒gp51基因的克隆、表达及ELISA抗体检测方法的建立

论文摘要

地方流行性牛白血病（Enzootic Bovine leukosis，EBL）是由牛白血病病毒（Bovine leukemia virus，BLV）引起的以淋巴细胞持续性增生为特征的传染性肿瘤性疾病。该病几乎遍布全世界各养牛国家，在某些牛群中血清阳性率高达60％，是影响世界养牛业发展的重要传染病之一。本研究利用PCR技术，克隆了BLV gp51基因片段，并在大肠杆菌中进行高效表达；以纯化的gp51表达蛋白为包被抗原，建立了牛血清中BLV抗体的ELISA检测方法，为BLV快速诊断试剂的研究奠定了基础。本研究主要进行了如下试验：1．以FLK-BLV病毒株为研究对象，通过培养FLK细胞获得大量BLV；用PCR技术扩增BLV gp51基因，将扩增片段克隆入pCR-Blunt载体并测序，然后用DNASTAR软件对克隆的gp51基因进行了分析；2．将gp51基因亚克隆入pET-32a表达载体，转化BL21（DE3）表达宿主菌，以IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE分析表达状况，并用Western-blot检测蛋白的免疫学反应性；扩大培养后，用不同浓度尿素溶液对包涵体进行洗涤、溶解并透析以纯化、溶解重组表达蛋白BLV-gp51，得到了纯化蛋白；3．以纯化的BLV-gp51蛋白作为抗原包被酶标板，建立血清中牛白血病病毒抗体的间接ELISA检测方法。方阵滴定确定抗原最佳包被浓度为2.19μg／mL，最佳血清稀释浓度为1：80，二抗最佳工作浓度为1：750；以gp51-ELISA分别检测牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻、赤羽病和蓝舌病阳性血清，结果全部为阴性，表明该方法与其它牛类病原抗体无交叉反应。用gp51-ELISA方法对172份被检血清进行了检测，总阳性率达11.63％。结果显示：①通过PCR法成功地扩增了BLV gp51基因，与参考文献中报道的gp51基因和氨基酸序列完全一致；②通过大肠杆菌表达了分子量约为43KD的融合蛋白，Western-blot试验显示表达蛋白BLV-gp51具有结合特异性抗体的活性，并获得了可溶性BLV-gp51；③建立的gp51-ELISA方法具有特异性强、灵敏度高、方便快速的特点，将为我国地方流行性牛白血病的监测和血清流行病学调查提供有效的技术手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1 牛白血病病毒与人类嗜T淋巴细胞病毒
• 2 EBL病原学研究
• 2.1 病原分类
• 2.2 BLV形态特征
• 2.3 BLV化学组成
• 2.4 BLV基因结构特征
• 2.4.1 长末端重复序列（long terminal repeat,LTR）
• 2.4.2 gag基因
• 2.4.3 pol基因
• 2.4.4 ENV基因
• BL序列'>2.4.5 pX_BL序列
• 2.5 BLV对外界环境的抵抗力
• 3 EBL流行病学特征
• 3.1 易感动物及潜伏期
• 3.2 发病率和死亡率
• 4 EBL的传播
• 4.1 分泌物传播
• 4.2 接触性传播
• 4.3 寄生昆虫引起的传播
• 4.4 血源性传播
• 4.5 乳源性传播
• 4.6 精液和胚胎移殖传播
• 4.7 胎盘传播
• 5 EBL临床症状和病理变化
• 5.1 临床症状
• 5.2 病理变化
• 6 EBL诊断方法研究进展
• 6.1 血液学变化
• 6.2 病原分离
• 6.3 动物试验
• 6.4 合胞体试验
• 6.5 放射免疫测定法（radioimmunoassay,RIA）
• 6.6 血清学诊断方法
• 6.6.1 琼脂凝胶免疫扩散（agar gel immunodiffusion,AGID）
• 6.6.2 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）
• 6.7 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）
• 6.8 Western-blot
• 6.9 PCR-ELISA
• 7 EBL疫苗研究概况
• 8 EBL防治措施
• 8.1 加强监测和检疫
• 8.2 隔离饲养或淘汰
• 8.3 消毒和灭蚊蝇
• 8.4 培养健康牛群
• 8.5 种公牛的管理和污染牛群犊牛的饲养
• 8.6 对饲养人员的管理
• 第二章 BLV gp51基因的克隆
• 1 研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 细胞和质粒
• 2.1.2 主要试剂与试剂盒
• 2.2 主要溶液的配制
• 2.3 主要仪器与设备
• 2.4 试验方法
• 2.4.1 BLV的增殖
• 2.4.2 BLV DNA的提取
• 2.4.3 BLV gp51基因PCR扩增
• 2.4.4 扩增产物的回收（按DNA片段回收试剂盒的说明步骤操作）
• 2.4.5 回收产物与pCR-Blunt载体的连接
• 2.4.6 重组质粒的转化（以下操作均在无菌状态下进行）
• 2.4.7 重组质粒的提取与鉴定
• 2.4.8 测序与结果分析
• 3 结果
• 3.1 BLV gp51基因PCR扩增
• 3.2 重组质粒的鉴定
• 3.3 BLV gp51基因的序列测定
• 3.4 序列测定分析
• 4 分析与讨论
• 4.1 BLV gp51基因的扩增
• 4.2 BLV gp51基因PCR扩增条件的优化
• 4.3 BLV gp51基因的克隆
• 5 小结
• 第三章 BLV gp51基因的原核表达与鉴定
• 1 研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株与质粒
• 2.2 主要试剂与试剂盒
• 2.3 主要溶液的配制
• 2.4 主要仪器与设备
• 2.5 试验方法
• 2.5.1 pCR-Blunt-gp51质粒的大量制备（碱裂解法）
• 2法）'>2.5.2 大肠杆菌BL21（DE3）感受态的制备（CaCl₂法）
• 2.5.3 gp51基因与pET-32a原核表达载体的连接
• 2.5.4 重组gp51的表达
• 2.5.5 表达蛋白的Western-blot检测
• 2.5.6 重组蛋白的大量表达与纯化
• 3 结果
• 3.1 gp51基因与pET-32a原核表达载体的连接
• 3.2 重组gp51的表达
• 3.3 重组蛋白的Western-blot检测
• 3.4 重组蛋白的大量表达与纯化
• 4 分析与讨论
• 4.1 重组gp51蛋白的表达
• 4.2 重组gp51蛋白的免疫原性
• 4.3 重组gp51蛋白的纯化
• 5 小结
• 第四章 牛白血病gp51-ELISA抗体检测方法的建立及初步应用
• 1 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 血清、酶标抗体、血清样品和对比试剂盒
• 2.1.2 ELISA主要试剂的配制
• 2.1.3 主要实验器材
• 2.2 方法
• 2.2.1 BLV-gp51的大量制备
• 2.2.2 gp51-ELISA最佳工作条件的确定
• 2.2.3 间接ELISA测定的基本实验步骤
• 2.2.4 ELISA阴阳性界限的确定
• 2.2.5 特异性试验
• 2.2.6 比对试验
• 2.2.7 血清样品的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 抗原最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定（方阵滴定）
• 3.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定
• 3.3 封闭浓度的确定
• 3.4 阴阳性血清最佳反应时间的确定
• 3.5 酶标二抗的作用时间的确定
• 3.6 底物作用时间的确定
• 3.7 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
• 3.8 特异性试验
• 3.8.1 交叉反应性
• 3.8.2 阻断试验
• 3.9 与现有试剂盒的比对试验
• 3.10 血清样品ELISA检测结果
• 4 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.2 结论
• 参考文献
• 致谢