人源Survivin N-端剪切体的体外生物学和谱学研究

人源Survivin N-端剪切体的体外生物学和谱学研究

论文摘要

Survivin是凋亡抑制蛋白家族中分子量最小的蛋白,它具有特殊的分子结构以及复杂的功能,并主要在细胞周期中的G2/M期表达,在医学诊断中发现其在恶性肿瘤、胚胎及特异组织中均有很高的表达水平。Survivin在生物体内具有调节细胞分裂以及抗细胞凋亡的双重功能,其基因在生物体内的异常改变将会导致肌体细胞增生异常以及自身凋亡通路受阻。以往对Survivin的研究重点基本都集中其在生物体内的作用机理和功能,任何能对关键结构域的构象产生影响的物理、化学和生物学因素,都将对溶液中二聚体的活性和稳定性产生干扰。本实验室针对人源Survivin N-端参与二聚体形成和稳定BIR结构域的主要残基,通过分子克隆的方法在E.coli中构建了野生型Survivin及多种N-端剪切体,并对其进行表达和纯化。利用生物化学和超分子化学相结合的手段,对模拟生理环境下Survivin及其剪切体的二聚稳定性、热稳定性、抗凋亡活性等展开研究。主要研究内容及结论如下:(1)首次构建并在原核生物中表达了多种人源Survivin N-端剪切体,圆二色谱检测目的蛋白的二级结构,结果表明经过透析复性的剪切体蛋白与野生型的全长SurF二级结构一致;(2)利用HPLC检测SurF及其剪切体在溶液中的分子量,确定均以二聚体的形式存在,证明N-末端序列不是形成二聚体的必要条件,并利用单分子力谱抻拉二聚分子的两端,从数值上直观的比较了N-末端序列对于形成二聚体的影响,结果表明,N-端参与二聚体形成的氨基酸只提供少量的作用力;(3)利用类似三明治ELISA的方法,在体外检测了SurF及其剪切体对Smac/DIABLO结合活性的区别,以此来检验N-末端序列对于Survivin抗凋亡功能的影响。结果表明,N-末端参与二聚体形成的氨基酸对抗凋亡活性影响不大,而维持完整的BIR结构域对于其抗凋亡活性则是必需的;(4)本实验还利用变温荧光、圆二和红外光谱对人源Survivin及其N-端剪切体进行热稳定性影响的研究,并利用二维相关光谱揭示了温度扰动下Surivivn及其N-端剪切体去折叠过程中二级结构变化,结果表明N-末端序列,尤其是影响BIR结构域的氨基酸的截取,大大降低了Survivin分子的三级结构稳定性,而对二级结构的变化影响不大。

论文目录

  • 内容提要
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  • 1.1 Survivin相关背景
  • 1.1.1 Survivin的分子组成及空间结构
  • 1.1.2 Survivin的主要生物学功能及作用机制
  • 1.1.3 Survivin在肿瘤治疗领域的应用前景
  • 1.2 本文的立题依据
  • 1.3 实验思路与设计
  • 参考文献
  • 第二章 Survivin N-端剪切体的构建及其蛋白纯化
  • 2.1 引言
  • 2.2 Survivin N-端剪切体的设计和构建
  • 2.2.1 实验主要试剂和仪器材料
  • 2.2.2 实验方法
  • 2.2.3 结果分析
  • 2.2.4 讨论
  • 2.3 Survivin N-端剪切体在Eschericoli coli中的表达
  • 2.3.1 实验主要试剂和仪器材料
  • 2.3.2 实验方法
  • 2.3.3 结果分析
  • 2.3.4 讨论
  • 2.4 Survivin N-端剪切体的分离纯化和表征
  • 2.4.1 实验主要试剂和仪器材料
  • 2.4.2 实验方法
  • 2.4.3 结果分析
  • 2.4.4 讨论
  • 本章小结
  • 参考文献
  • 第三章 Survivin N-端剪切体的单分子力谱和活性检测
  • 3.1 引言
  • 3.2 Survivin N-端剪切体的的二聚化研究
  • 3.2.1 实验主要试剂和仪器材料
  • 3.2.2 实验方法
  • 3.2.3 结果分析
  • 3.2.4 讨论
  • 3.3 Survivin N-端剪切体与Smac/DIABLO结合活性研究
  • 3.3.1 实验主要试剂和仪器材料
  • 3.3.2 实验方法
  • 3.3.3 结果分析
  • 3.3.4 讨论
  • 本章小结
  • 参考文献
  • 第四章 Survivin N-端剪切体的变温谱学研究
  • 4.1 引言
  • 4.1.1 蛋白质的构象以及折叠/去折叠的过程
  • 4.1.2 二维波数-波数相关分析
  • 4.2 Survivin N-端剪切体的变温光谱研究
  • 4.2.1 实验主要试剂和仪器材料
  • 4.2.2 实验方法
  • 4.2.3 实验结果
  • 4.2.4 讨论
  • 4.3 Survivin N端剪切体的变温红外二维相关分析
  • 4.3.1 实验方法
  • 4.3.2 结果分析与讨论
  • 本章小结
  • 参考文献
  • 作者简历
  • 博士学位论文期间发表论文及其它成果
  • 致谢
  • 相关论文文献

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