中国荷斯坦牛Nramp1基因部分序列分析及其与乳腺炎关联研究

论文摘要

本试验设计4对引物Primer1,Primer2,Primer3和Primer4分别扩增第9、第10、第11外显子和第12内含子。采用PCR-SSCP方法首次研究了中国荷斯坦牛Nramp1基因exon9,exon10和exon11序列及其与奶牛乳腺炎的关联性。结果如下:在Primer1,Primer2和Primer3的扩增片段中共发现3个SNP多态位点,位于Nramp1基因序列的7012bp（第9内含子）、7401bp（第11外显子）和7455bp（第11外显子）处。Primer1的PCR扩增产物不具有SNP位点。Primer2的PCR扩增产物经PCR-SSCP检测到3种基因型MM,MN和NN,基因型频率分别为0.756,0.198和0.046,基因型分布服从Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05）。等位基因M和N的基因频率分别为0.854和0.146,其中M为优势等位基因。基因型为多态信息含量为0.2183,显示该位点遗传多态性为低度多态（PIC＜0.25）。测序分析检测到7012bp的C/T突变,处于内含子9中（GenBank登录号:EU281620）。Primer3的PCR扩增片段经PCR-SSCP检测到3种基因型AA,AB和BB,基因型频率分别0.610,0.314和0.076,基因型分布服从Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。等位基因A和B的基因频率分别为0.767和0.233,其中A为优势等位基因。基因型为多态信息含量为0.2942,显示该位点遗传多态性为中度多态（0.25＜PIC＜0.05）。测序分析检测到2个SNPs,均处于外显子10中,分别为7401bp的G/C突变和7455bp的A/C突变,分别导致Pr0356Ala和Leu374Met替换。Primer4克隆测序得到了intron12的部分准确序列并提交到NCBI数据库（GenBank登录号:EF682067）。GLM分析了扩增片段不同基因型与与奶牛乳腺炎的关联性,结果显示牛场效应和产犊季节对体细胞评分的影响极显著（P＜0.01）,胎次对体细胞评分的影响显著（P＜0.05）,不同基因型对体细胞评分的影响不显著（P＞0.05）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 免疫概述
• 1.1.1 天然免疫与获得性免疫
• 1.1.2 吞噬作用
• 1.1.3 炎症
• 1.1.4 胞内菌在宿主细胞内生存的机制
• 1.2 奶牛乳腺炎的研究概况
• 1.2.1 定义与分类
• 1.2.2 发生与发病率
• 1.2.3 危害
• 1.2.4 诊断
• 1.2.5 防治现状与发展方向
• 1.2.6 遗传学研究
• 1.3.NRAMP1基因的研究进展
• 1.3.1.Nrampl基因概述
• 1.3.2 Nramp1的结构和功能
• 1.3.3 Nramp1基因的表达调控
• 1.3.4 Nramp1基因与疾病的关系
• 1.4 SSCP技术的研究概况
• 1.4.1 SSCP的建立与发展
• 1.4.2 PCK-SSCP方法的优缺点
• 1.4.3 PCR-SSCP的应用
• 1.4.4 SRP及其研究方法
• 1.5 研究的目的意义与内容
• 2 试验材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验样本
• 2.1.2 牛奶体细胞测定
• 2.1.3 试验主要仪器设备
• 2.1.4 试验主要试剂及配制
• 2.1.5 引物信息及PCR反应条件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 基因组DNA提取
• 2.2.3 PCR-SSCP分析与基因型判定
• 2.2.4 内含子12的克隆测序
• 2.3 序列结果
• 2.4 数据统计分析
• 2.4.1 数据收集和处理
• 2.4.2 奶牛乳腺炎的判断标准
• 2.4.3 基因频率和基因型频率的计算
• 2.4.4 遗传多态性分析
• 2.4.5 Hardy-Weinberg平衡状态的检验
• 2.4.6 不同基因型与生产性状的相关分析
• 3 结果与分析
• 3.1 模板DNA的抽提和序列分析结果
• 3.1.1 模板DNA的抽提结果
• 3.1.2 PCR-SSCP的检测结果
• 3.1.3 内含子12的克隆测序
• 3.1.4 Nramp1基因部分序列测序结果
• 3.2 NRAMP1基因的遗传学分析
• 3.2.1 Nramp1基因型频率和基因频率
• 3.2.2 Nramp1基因的遗传多态性分析
• 3.2.3 Hardy-Weinberg平衡的检验
• 3.3 不同基因型与生产性状的相关分析
• 4.讨论
• 4.1 PCR反应条件的优化
• 4.2 中国荷斯坦牛NRAMP1基因的遗传特征
• 4.3 SCC评估乳腺炎的优缺点
• 4.4 牛NRAMP1基因多态性与SCS的关联性
• 4.5 影响奶牛乳腺炎的因素分析
• 4.5.1 牛场对奶牛乳腺炎的影响
• 4.5.2 基因型对奶牛乳腺炎的影响
• 4.5.3 胎次对奶牛乳腺炎的影响
• 4.6 NRAMP1基因序列完整性分析
• 5.结论
• 参考文献