人参皂甙Rb3的生物转化以及拟青霉菌sp.229中代谢产物的分离纯化鉴定

论文摘要

本论文的研究内容包括人参皂甙Rb3微生物转化和拟青霉菌sp.229代谢产物的研究两部分。经过长期的研究,本实验室从人参种植区土壤里分离筛选得到含有大量糖苷酶的拟青霉菌,经过诱变、筛选得到拟青霉菌sp.229,能够高效地转化人参皂苷Rb1为稀有人参皂甙Compound-K（C-K）,克分子转化率达到75%以上。人参皂甙Rb3同属于二醇类人参皂甙,与Rb1结构很相似,而且在自然界,尤其是三七茎叶中含量较高,但是目前还未见有对人参皂甙Rb3进行微生物转化的研究报道。本研究首先探索了人参皂甙Rb3的HPLC的分离方法,并建立了其标准曲线,对三七茎叶总皂甙中Rb3的含量进行测定,测定三七茎叶总皂甙中Rb3的含量。同时对三七茎叶总皂甙进行柱层析分离,经过正相硅胶和反相硅胶反复层析后,制备得到纯度95%以上的人参皂甙Rb3作为下一步微生物转化的底物。在积累足够量的人参皂甙Rb3底物后,进行人参皂甙Rb3可制备量的发酵转化,并对发酵产物进行分离鉴定,探索人参皂甙Rb3的代谢途径。已鉴定的代谢产物有人参皂甙Mx以及人参皂甙C-K,其中首次对人参皂甙Mx进行了X-ray衍射分析,并建立人参皂甙Mx的HPLC分离条件和标准曲线。此后,进一步对人参皂甙Rb3的代谢途径展开研究,分别对不同时间发酵产物、不同时间粗酶直接转化产物、不同时间固定化酶转化产物、不同投入量底物固定化酶转化产物进行TLC以及HPLC的分析,分析人参皂甙Rb3的代谢特点,探索其转化途径。推测出人参皂甙Rb3在拟青霉菌sp.229的作用下可能的转化途径为:Rb3→Gypenoside IX→Mx→C-K。本研究继续对人参皂甙Rb3的发酵条件进行优化,分别进行碳源、氮源筛选,探索了生长因子、表面活性剂对发酵的影响,并通过正交法对人参皂甙Rb3的发酵条件的六个因素进行了优化,确定最佳的转化条件为:3%蔗糖、3%酵母粉、0.1%麸皮粉、0.1%MgSO4、0.15%CaCl2及0.2%（NH4）2SO4,克分子转化效率提高至28.2%。微生物由于其丰富的代谢产物,越来越受到研究者的重视,除了抗生素外,微生物还产生许多其它活性化合物,包括黄酮、生物碱、皂甙等结构的化合物都有被发现。微生物代谢产物已经成为治疗恶性肿瘤、艾滋病、心脑血管等病症药物的重要来源之一。本研究对拟青霉菌sp.229代谢产物也进行了初步分离,经过反复柱层析分离得到两个甾体类化合物,并制备得到结晶,进行了X-ray衍射分析,鉴定为过氧麦角甾和麦角甾醇。这是首次从该菌株中分离得到这两个化合物,为它们的制备提供了一条新的途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 3的产物研究'>第一部分 微生物转化人参皂甙Rb₃的产物研究
• 前言
• 3的含量测定及制备'>第一章 人参皂甙Rb₃的含量测定及制备
• 1.材料与设备
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 2.实验方法
• 2.1 高效液相色谱法
• 2.2 薄层色谱法
• 3的分离与纯化'>2.3 人参皂甙Rb₃的分离与纯化
• 3.实验结果
• 3标准曲线'>3.1 人参皂甙Rb₃标准曲线
• 3含量'>3.2 HPLC法测定人参皂甙Rb₃含量
• 3的分离纯化'>3.3 三七茎叶总皂甙中Rb₃的分离纯化
• 4 讨论
• 3的生物转化产物的分离鉴定、代谢途径的研究和人参皂甙Mx体外肿瘤细胞增殖抑制活性研究'>第二章 Rb₃的生物转化产物的分离鉴定、代谢途径的研究和人参皂甙Mx体外肿瘤细胞增殖抑制活性研究
• 1.材料与设备
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 2.实验方法
• 3的发酵及产物分离纯化鉴定'>2.1 人参皂甙Rb₃的发酵及产物分离纯化鉴定
• 3.'>2.2 酶法转化人参皂甙Rb₃.
• 2.3 人参皂甙Mx发酵产物体外肿瘤细胞增殖抑制试验
• 3.实验结果
• 3'>3.1 微生物转化人参皂甙Rb₃
• 3'>3.2 酶法转化人参皂甙Rb₃
• 3.3 人参皂甙Mx体外肿瘤细胞增殖抑制活性
• 4.讨论
• 3的发酵转化到C-K的条件优化'>第三章 人参皂甙Rb₃的发酵转化到C-K的条件优化
• 1.实验材料
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 2.试验方法
• 3'>2.1 发酵法转化人参皂甙Rb₃
• 2.2 发酵条件的优化
• 3.实验结果
• 3.1 原始培养基转化率
• 3.2 碳源影响
• 3.3 氮源影响
• 3.4 生长因子影响
• 3.5 表面活性剂印象
• 3.6 正交优化
• 4.讨论
• 第二部分 拟青霉菌sp.229中代谢产物的分离纯化及X-ray单晶衍射分析鉴定
• 1.前言
• 2.材料与设备
• 2.1 药品与试剂
• 2.2 仪器与设备
• 3.实验方法
• 3.1 10 L发酵罐二级发酵工艺建立
• 3.2 代谢产物的分离纯化
• 3.3 晶体培养制备
• 4.实验结果
• 4.1 发酵液菌体收集及代谢粗产物提取
• 4.2 代谢产物的分离纯化
• 4.3 X-ray单晶衍射分析与鉴定
• 5.讨论
• 引用文献
• 综述 二醇型人参皂甙的生物转化研究进展
• 致谢
• 附录