论文摘要
2型糖尿病是由胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍导致的糖代谢紊乱疾病,常伴有高脂血症。过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs）是依赖配体激活的核受体超家族成员之一,与配体结合后转录活性发生变化,导致PPARs靶基因表达的改变,从而引起脂肪细胞分化、脂质代谢等一系列生理活动。由周期素依赖性蛋白激酶9 （Cyclin-dependent kinase 9, CDK9）和细胞周期调节蛋白T1 （cyclin T1）组成的正性转录延伸因子b （Positive transcription elongation factor b, P-TEFb）可被一些转录因子招募以激活特异启动子的转录延伸,参与多种细胞的分化过程。PPARs在机体的糖脂代谢中起着重要作用,与糖尿病和高脂血症等的发生发展密切关系,临床上常用的胰岛素增敏型抗糖尿病药物罗格列酮就属于PPARγ激动剂,其中常用的降脂药物非诺贝特即为PPARα激动剂。单一的PPARγ激动剂药物存在体重增加、水肿和可能增加心血管事件等副作用,且无法改善脂代谢紊乱症状。中药单体成分小檗碱（Berberine）已有用于治疗糖尿病和高脂血症的实验和临床报道,但其确切机制尚未阐明。目的观察小檗碱对2型糖尿病大鼠血糖血脂和肝脏、骨骼肌中糖脂代谢,以及脂肪组织中PPARs和P-TEFb的mRNA和蛋白表达的影响。筛选最佳小干扰RNA （Small interference RNA, siRNA）序列,在最佳干扰浓度和时间下沉默CDK9 mRNA表达,3T3-L1细胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclin T1 mRNA和蛋白的改变及小檗碱的干预作用。旨在探讨小檗碱对2型糖尿病的治疗作用及其改善糖脂代谢作用与PPARs/P-TEFb表达的关系,阐明小檗碱治疗糖尿病的作用机制。方法1. 2型糖尿病大鼠模型的建立:大鼠禁食12 h后用于建立2型糖尿病模型,根据文献及预实验确定链脲菌素（Streptozotocin, STZ）剂量为35 mg/kg,正常对照组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。标准饲料喂养2周,挑选空腹血糖值≥16.7 mmol/L的糖尿病大鼠改用高糖高脂饲料喂养14周以诱导高脂血症,正常对照组大鼠一直用标准饲料喂养。2.实验分组及给药:于16周将空腹血糖值≥16.7 mmol/L的糖尿病大鼠按血糖值随机分为糖尿病模型组、小檗碱低、中、高剂量组（75、150、300 mg/kg）、非诺贝特组（100 mg/kg）和罗格列酮组（4 mg/kg） 6组,非诺贝特和罗格列酮作为阳性对照药。实验共分7组,其中正常对照组由同批次正常大鼠组成,每组10只动物。大鼠单笼饲养,每天拌食给药1次,连续给药16周,每4周测1次空腹血糖,每2周称1次体重,并根据体重调整给药剂量。3. 2型糖尿病大鼠血糖、血脂、血清胰岛素等血液指标的检测:处死大鼠前禁食12 h,麻醉后心脏取血,每组5只大鼠用4%多聚甲醛灌注固定后取组织称重再固定,进行后续处理;另5只大鼠直接快速取组织称重后液氮冻存或固定后石蜡包埋。按相应方法进行血中血糖、甘油三酯（Triglyceride, TG）、总胆固醇（Total cholesterol, TC）、高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、载脂蛋白（Apolipoprotein, Apo）AI、ApoB、游离脂肪酸（Free fatty acid, FFA）、血清胰岛素、糖化血红蛋白（Hemoglobin A1c, HbA1c）、总脂酶、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha, TNF-α）和脂联素等指标的检测。4.观察胰岛普通、超微病理结构和胰岛素的表达:HE染色法观察胰岛的普通病理结构改变,运用透射电镜技术观察胰岛的超微病理结构变化。采用免疫组化技术检测胰岛内胰岛素的表达,使用相应试剂盒检测胰腺中的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）活性和丙二醛（Malonaldehyde, MDA）含量。5.肝脏和骨骼肌中糖脂代谢的检测:油红O染色法观察肝脏冰冻切片中脂质分布情况,过碘酸-希夫（氏）（PAS）染色法观察肝脏中糖原的分布情况。用糖原、FFA、TG检测试剂盒分别测定肝脏和骨骼肌中糖原、FFA、TG含量。6.脂肪组织中PPARs、P-TEFb mRNA和蛋白表达等的测定:分别采用real time PCR和western blotting检测脂肪组织中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclin T1 mRNA和蛋白的表达。按相应方法检测脂肪组织中的TNF-α、脂联素、FFA、总脂酶、SOD和MDA等指标。采用HE染色观察脂肪组织细胞的大小和数量。7. 3T3-L1脂肪细胞的增殖、分化和脂质集聚:培养3T3-L1脂肪细胞,运用MTT法和油红O染色法观察小檗碱对3T3-L1细胞增殖、脂肪细胞分化情况及采用western blotting检测脂肪细胞分化标记物aP2蛋白的表达。8. 3T3-L1脂肪细胞中PPARs、P-TEFb表达的检测:3T3-L1脂肪细胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclin T1 mRNA、蛋白表达、TNF-α、脂联素含量、细胞分化和细胞内脂质集聚的测定,以及在小檗碱、非诺贝特和罗格列酮作用下上述指标的变化。9.最佳RNA干扰（RNAi）条件的确定:采用荧光标记的FAM-siRNA优化转染条件,运用real time PCR技术筛选最佳CDK9的siRNA序列,确定最有效siRNA沉默基因的最佳干扰浓度和时间,并观察siRNA转染后CDK9蛋白表达随时间的变化。10. RNAi下3T3-L1脂肪细胞中PPARs、P-TEFb表达的检测:应用最有效siRNA序列的最佳干扰浓度转染,在沉默CDK9基因情况下,PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclin T1表达、TNF-α、脂联素含量、细胞分化和细胞内脂质集聚的改变,以及在小檗碱、非诺贝特和罗格列酮作用下这些指标的变化。结果1. 2型糖尿病大鼠的空腹血糖、HbA1c较正常对照大鼠升高,TG、TC、LDL-C、ApoB和FFA与正常对照大鼠比较明显增高,HDL-C、ApoAI则降低,血清胰岛素较正常对照大鼠升高,表明成功建立了2型糖尿病大鼠模型。2.小檗碱能明显降低2型糖尿病大鼠血糖和HbA1c水平,降低TG、TC、LDL-C、ApoB、FFA含量和增加HDL-C、ApoAI含量。小檗碱还可增加糖尿病大鼠肝脏和骨骼肌中糖原含量并降低FFA、TG含量。3.小檗碱明显降低糖尿病大鼠血清胰岛素含量,提高胰岛素敏感指数和增加β细胞内胰岛素含量;增加胰腺重体重比值,HE染色显示小檗碱增加胰岛面积和β细胞数量,透射电镜结果表明小檗碱使胰岛β细胞中分泌颗粒数量上升,改善病变的超微结构;小檗碱增强胰腺中SOD活性和降低MDA含量。4.小檗碱明显降低糖尿病大鼠血清和脂肪组织中FFA、MDA、TNF-α含量,增加脂联素含量,增强总脂酶和SOD活性,具有促进脂质代谢、抗氧化和调节脂肪因子分泌的功能。5.小檗碱明显增强糖尿病大鼠脂肪组织中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9和cyclin T1 mRNA、蛋白的表达,降低内脏脂肪重比重比值和脂肪细胞大小,增加脂肪细胞数量。6.小檗碱在低浓度时促进3T3-L1细胞增殖和在高浓度时抑制其增殖,能浓度依赖性地促进脂肪细胞分化和降低脂质积聚。小檗碱可促进3T3-L1脂肪细胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9和cyclin T1 mRNA、蛋白的表达,抑制TNF-α分泌而增加脂联素分泌。7. siRNAa为最佳沉默CDK9基因表达序列,最佳干扰浓度和时间分别为50 nmol/L和48 h。转染后48 h CDK9蛋白表达明显减弱,96 h恢复至正常水平。8.在最有效siRNA序列最佳干扰浓度和时间条件下沉默CDK9基因表达,3T3-L1脂肪细胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9和cyclin T1 mRNA、蛋白表达均受到抑制,TNF-α分泌增加而脂联素分泌受到抑制。小檗碱对干扰效应具有翻转作用,能促进PPARs和P-TEFb表达,降低TNF-α分泌和促进脂联素分泌,促进细胞分化和降低脂质集聚。结论本研究一次性腹腔注射小剂量链脲菌素,造成部分胰岛β细胞破坏,使其发生糖尿病,接着采用高糖高脂饲料喂饲以诱发糖尿病大鼠的高脂血症。该模型不仅表现胰岛素抵抗,而且部分胰岛β细胞功能受损,糖脂代谢紊乱明显,与人类2型糖尿病病理机制相似,因此用来评价降糖调脂药物的疗效,结果可信。小檗碱对2型糖尿病大鼠具有明显的降糖调脂作用,除降低血糖、HbA1c水平和改善血脂代谢异常,还增加骨骼肌和肝糖原含量和降低脂质在肝脏、骨骼肌组织中的堆积。小檗碱能促进胰岛β细胞再生和增加β细胞内胰岛素含量。小檗碱通过调节糖脂代谢的平衡和恢复胰岛β细胞功能来改善胰岛素抵抗,引起血清胰岛素水平的降低。小檗碱通过使糖尿病大鼠脂肪组织中降低了的PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclin T1表达恢复至接近正常大鼠水平,从而改善糖尿病大鼠的糖脂代谢。小檗碱能促进3T3-L1细胞分化和降低脂质积聚,其作用与通过促进3T3-L1脂肪细胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclin T1表达相关,与糖尿病大鼠实验结果相一致。RNAi下沉默CDK9基因,3T3-L1细胞中PPARα、PPARδ、PPARγ、CDK9、cyclin T1表达受到抑制,小檗碱具有翻转并促进表达的作用。因此CDK9参与PPARs的表达调控,在PPARs与P-TEFb共同参与脂肪细胞分化和脂质集聚中有着重要作用,小檗碱可部分地通过影响CDK9参与脂肪细胞的分化功能,进而影响PPARs活性,使组织中糖脂代谢活动及相关酶、脂肪因子等恢复至接近常态,最终使2型糖尿病大鼠的糖脂代谢紊乱症状得以改善。因此,小檗碱的降糖调脂作用与其通过调控PPARs/P-TEFb信号转导通路相关,即小檗碱通过调控PPARs/P-TEFb信号转导通路是其降糖调脂作用的机制之一。
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