内源二十碳二烯酸和二十碳三烯酸对拟南芥生理影响及植物XB3-like蛋白家族功能研究

论文摘要

植物的固着性使它整个生命过程中不可避免面临各种不利的外部环境（如干旱胁迫、盐胁迫、涝害、高温、低温、病原菌侵袭等）。在长期的进化过程中，植物形成了一套响应胁迫和提高抗性的机制。因此，理解植物应答逆境胁迫伤害、适应性变化等诸多生理过程，对提高农作物的产量和品质有重要意义。内源二十碳二烯酸和二十碳三烯酸对拟南芥生理影响VLCPUFA（svery long chain polyunsaturated fatty acids）对人体营养和健康非常重要。虽然人体自身能够合成VLCP(UFAs，但其效率极低。目前，该类脂肪酸的主要来源是深海鱼油，其主要有效成分是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。但由于过度捕捞、环境污染等诸多原因，导致鱼油的供给已远不能满足市场需求。随着植物转基因技术的发展，许多生产超长链多不饱和脂肪酸的转基因油料作物已诞生，如油菜，大豆和亚麻等。因此，研究这些异源脂肪酸在植物生理和对非生物胁迫的耐受性具有可行性。该研究将为转基因植物中商业化生产超长连多不饱和脂肪酸奠定理论基础。我们以內源合成二十碳二烯酸（EDA）和二十碳三烯酸（ETrA）的转IgASE1基因的拟南芥作为材料，结合外源添加实验，研究EDA和ETrA对拟南芥的生理表型及干旱胁迫的耐受性的影响。主要研究结果总结如下：（1）RT-PCR分析表明，IgASE1基因在转基因拟南芥中表达；气相色谱分析其叶片脂肪酸组成，结果表明：內源合成的EDA和ETrA占总脂肪酸含量的25.6mol%；叶片膜脂组成分析表明，EDA和ETrA参与了生物膜脂的构成，从而将膜脂内不饱和脂肪酸的含量由野生型的59.6mol%，增加到转基因植株中73.7mol%。（2）连续多代拟南芥生长表型调查结果表明，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥表型上有差异：苗期生长缓慢，花较小且花瓣较薄，种子更饱满，后熟时间缩短。（3）外源添加ABA实验结果显示，与野生型拟南芥相比转基因拟南芥在种子萌发，苗期生长及气孔的张开方面对ABA的敏感性增强。（4）选用萌发后3天的幼苗和萌发后3周的苗子分别进行模拟干旱和断水处理实验，结果表明转基因拟南芥比野生型拟南芥对干旱的耐受能力强。利用qRT-PCR分析依赖于ABA途径的关键基因（RD29B、 RD26和CBF3）和非依赖于ABA途径的关键基因（COR15A、ADH1和CBF2）的表达情况，结果表明转基因拟南芥对干旱的强耐受力来源于依赖ABA途径和非依赖ABA途径的共同作用。（5）外源添加EDA和ETrA可以在野生型中模拟转基因拟南芥对ABA敏感和对干旱耐受的表型，即EDA和ETrA在拟南芥对ABA和干旱的响应过程中作用。植物XB3-like蛋白家族功能研究具有同源性结构域及序列，进化上相关的蛋白质归在同一个蛋白家族，对蛋白家族的分析研究有利于对该蛋白家族的功能及进化进行系统研究。随着基因组测序的飞速发展，至今已有五十多种植物完成或正在进行全基因组测序，这为在多个物种中分析比对一个蛋白家族提供可行性。水稻XB3，是XA21丝氨酸/苏氨酸激酶的底物，在XA21介导的抗病途径中起到重要作用。在拟南芥中同源基因有5个，分别命名为XBAT31、XBAT32、XBAT33、XBAT34和XBAT35。对XBAT32和XBAT35的研究发现，它们在植物的生长发育及抗逆过程中起到重要作用。经过我们对这些蛋白结构分析发现，它们都包括锚定重复序列（ANK）和保守的C3HC4型指环结构。因此，我们将同时含有ANK和C3HC4指环结构的蛋白归为一个蛋白家族，并命名为XB3-like蛋白家族。本研究利用生物信息学的方法分析比对数据库提供的所有物种序列（29种），对该蛋白家族的功能及进化进行系统研究，以期找到具有合适功能的基因用于生产实践。（1）我们利用生物信息学方法从已公布的29种全基因组测序的物种中搜索到187个同时具有ANK和C3HC4型指环结构的蛋白。因其与XB3结构上相似，我们命名为XB3-like蛋白家族，编码这组蛋白的基因命名为XB3-like基因家族。对29个物种中XB3-like基因的数量统计后发现，两种藻中无XB3-like基因，结果说明该蛋白家族在植物进化过程中可能是由蕨类开始出现的。（2）根据XB3-like蛋白间的同源性关系构建进化树，发现该家族蛋白可分为三组，且三组蛋白的指环结构域之间存在明显差异。另外，我们还发现多数植物中XB3-like蛋白分别属于上述三组蛋白，而蓖麻和苜蓿中仅有2个XB3-like蛋白且都属于第Ⅰ组。（3）对模式植物拟南芥和三种作物（水稻、玉米和大豆）的芯片分析结果显示，该基因家族在植物的整个生命周期和不同的组织中均有广泛表达和偏好性表达，这个结果说明该家族基因可能在植物不同发育阶段和不同组织发挥重要的生物学功能。（4）我们利用荧光定量的方法检测到拟南芥和玉米中多个XB3-like基因的表达受激素和非生物胁迫信号的影响，预示着它们可能在植物生长发育以及胁迫响应过程中扮演了重要角色。（5）拟南芥XBAT31表达受多种激素和非生物胁迫信号的诱导。于是我们对XBAT31基因的功能产生兴趣。我们将基因上游2Kb启动子序列与GUS报告基因连接后表达，发现XBAT31在不同组织均有表达，其中茎、叶及花序中表达量较高。（6）XBAT31基因低量表达突变体在萌发期和苗生长早期对盐胁迫耐受性较野生型拟南芥低。其中，突变体内非依赖ABA途径内的基因表达量明显降低，可能是使突变体在萌发期和苗期对盐胁迫的耐受性降低的原因。因此，我们推测XBAT31在盐胁迫信号的转导过程中可能起正向作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 二十碳二烯酸和二十碳三烯酸是超长链多不饱和脂肪酸
• 1.2 超长链多不饱和脂肪酸在植物中的合成
• 1.3 长链脂肪酸在植物中的作用
• 1.3.1 贮存碳源和能量
• 1.3.2 生物膜的重要组分
• 1.3.3 参与植物信号转导
• 1.4 VLCPUFAs 与生物胁迫
• 1.5 非生物胁迫
• 1.5.1 盐胁迫
• 1.5.1.1 盐胁迫对植物的危害
• 1.5.1.2 植物对盐胁迫的适应机制
• 1.5.1.3 盐胁迫信号转导
• 1.5.2 干旱胁迫
• 1.5.2.1 干旱对植物的伤害
• 1.5.2.2 植物对干旱胁迫的适应机制
• 1.5.2.3 干旱胁迫的信号转导途径
• 1.6 脱落酸（ABA）
• 1.6.1 ABA 的代谢过程
• 1.6.1.1 ABA 的生物合成
• 1.6.1.2 ABA 的分解代谢
• 1.6.2 ABA 的信号转导
• 1.6.2.1 ABA 的感受
• 1.6.2.2 ABA 信号转导途径
• 1.6.3 ABA 与植物生长发育
• 1.6.4 ABA 与非生物胁迫的关系
• 1.7 XB3-like 蛋白家族研究现状
• 1.8 本实验的目的意义
• 1.8.1 异源二十碳二烯酸和二十碳三烯酸对拟南芥生理影响
• 1.8.2 植物 XB3-like 蛋白家族功能研究
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶与各种生化试剂
• 2.1.4 主要实验仪器
• 2.1.5 生物信息学工具
• 2.1.5.1 生物信息分析软件
• 2.1.5.2 生物信息分析网站
• 2.1.6 本论文所用引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物基因组的提取与纯化（小量法）
• 2.2.2 植物 cNDA 的获得
• 2.2.2.1 植物 RNA 的提取（TriZol 法）
• 2.2.2.2 RNA 浓度测定
• 2.2.2.3 RNA 甲醛变性胶电泳检测
• 2.2.2.4 RNA 的纯化
• 2.2.2.5 cDNA 第一链的合成
• 2.2.3 载体构建
• 2.2.3.1 PCR 扩增
• 2.2.3.2 酶切和胶回收
• 2.2.3.3 去磷酸化反应
• 2.2.3.4 连接反应
• 2.2.3.5 表达载体的构建
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4.2 大肠杆菌细胞的转化
• 2.2.5 大肠杆菌中质粒的提取
• 2.2.6 农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.6.1 农杆菌 GV3101 感受态细胞的制备
• 2.2.6.2 冻融法转化农杆菌感受态细胞
• 2.2.7 拟南芥的转化及转基因植株的鉴定
• 2.2.7.1 拟南芥的转化
• 2.2.7.2 转基因拟南芥的鉴定
• 2.2.8 荧光定量 PCR
• 2.2.9 转基因植物 GUS 组织化学染色分析
• 2.2.10 植物总脂肪酸的提取及分析
• 2.2.11 植物膜脂的提取及分析
• 2.2.12 原核表达蛋白及纯化
• 2.2.12.1 原核表达蛋白
• 2.2.12.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.12.3 包涵体蛋白的提取
• 2.2.12.4 蛋白亲和层析纯化
• 2.2.12.5 蛋白复性及浓缩
• 2.2.12.6 蛋白浓度测定（考马斯亮蓝法）
• 2.2.13 抗体的制备及效价检测
• 2.2.13.1 抗体的制备
• 2.2.13.2 效价检测（酶联免疫吸附法）
• 2.2.14 植物总蛋白的提取及检测
• 2.2.14.1 植物总蛋白的提取
• 2.2.14.2 Western Blot 检测蛋白表达
• 3 结果与分析
• 3.1 异源二十二碳二烯酸和二十二碳三烯酸对拟南芥生理功能影响
• 3.1.1 转基因拟南芥的鉴定
• 3.1.2 异源长链多不饱和脂肪酸参与膜脂的组成
• 3.1.3 转基因拟南芥与野生型拟南芥相比表型上有差异
• 3.1.4 转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对 ABA 更敏感
• 3.1.5 转基因拟南芥耐旱能力增强
• 3.1.6 转基因拟南芥通过依赖 ABA 和非依赖 ABA 两条途径增加耐旱性
• 3.1.7 外源添加 EDA 和 ETrA 使野生型拟南芥对 ABA 敏感且耐旱
• 3.2 植物 XB3-like 蛋白家族功能研究
• 3.2.1 植物 XB3-like 蛋白的鉴定
• 3.2.2 植物 XB3-like 基因同源性分析
• 3.2.3 植物 XB3-like 蛋白的分类
• 3.2.4 XB3-like 基因在拟南芥、水稻、玉米和大豆中的表达模式
• 3.2.5 在拟南芥和玉米中分析 XB3-like 基因对多种激素和分生物胁迫的响应
• 3.2.6 XBAT31 生物学功能的初探
• 3.2.6.1 XBAT31 同源基因进化关系分析
• 3.2.6.2 XBAT31 启动子分析
• 3.2.6.3 XBAT31 组织定位和亚细胞定位
• 3.2.6.4 XBAT31 受多种激素和模拟非生物胁迫的诱导
• 3.2.6.5 突变体、超表达拟南芥及 XBAT31 抗体的获得
• 3.2.6.6 XBAT31 突变体不耐盐胁迫
• 3.2.6.7 XBAT31 泛素连接酶活性的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 异源二十碳二烯酸和二十碳三烯酸对拟南芥生理影响
• 4.2 植物 XB3-like 蛋白家族功能研究
• 5 结论
• 5.1 异源二十碳二烯酸和二十碳三烯酸对拟南芥生理影响
• 5.2 植物 XB3-like 蛋白家族功能研究
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况