哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应信号分子的检测及其合成基因luxI的功能

论文摘要

哈密瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp.citrulli）是西瓜、甜瓜、哈密瓜等葫芦科植物上的一种重要的病原细菌。近年来果斑病的发生趋势有所上升,对我国哈密瓜及其他瓜类生长造成严重威胁,常造成严重的经济危害。目前,对果斑病菌的研究主要集中于传播机理,防治措施等方面,对于其致病机理的研究少有报道。本研究利用AHL超敏感生物检测菌株JZA1（pJZ372）（pJZ384）（pJZ410）对哈密瓜细菌性果斑病菌（A.avenae subsp.citrulli）产生群体感应信号分子的能力进行了检测,定量的β-半乳糖苷酶活性检测与定性的反向薄层层析检测表明该菌株可以产生一定活性的、1种类型（C8-AHL）的群体感应信号分子,说明哈密瓜果斑病菌中存在QS系统。同时,在我们检测的57株哈密瓜果斑病菌菌株中,39株菌株能产生群体感应信号分子,18株未检测到AHL类信号分子,说明QS系统在哈密瓜果斑病菌中存在差异。利用分子生物信息学,通过同源性比对,在哈密瓜果斑病菌的全基因中发现了信号分子的合成基因acluxⅠ。通过PCR技术,从AHL产生菌株xjL12中扩增了acluxⅠ基因。将克隆的acluxⅠ基因在autoinducer-Ⅰ（AI-1）AI-1缺陷的菌株Escherichia coliDH5α中原核表达,发现DH5α可恢复产生AI-1的能力。利用同源重组技术,构建了acluxⅠ基因的缺失突变株,信号分子检测和致病性测定试验表明,acluxⅠ缺失突变株完全丧失了合成AI-Ⅰ的能力,同时其在西瓜果实和幼苗上的致病性也显著降低,但不影响其生长能力。我们研究表明,群体感应调节系统在哈密瓜果斑病菌的致病性中扮演着十分重要的角色。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 一、细菌中的群体感应系统
• 1 AHLS介导的革兰氏阴性菌群体感应系统
• 1.1 费氏弧菌（VIBRIO FISCHERI）LUXR/LUXI型群体感应系统
• 1.2 AHL分子结构及其合成
• 1.2.1 LuxI类合成酶
• 1.2.2 LuxM/AinS类合成酶
• 1.2.3 HtdS类合成酶
• 1.3.AHLs介导的群体感应的生理学功能
• 2 寡肽类物质介导的革兰氏阳性茵群体感应系统
• 2.1 寡肽类信号分子及其受体传导过程
• 2.2 革兰氏阳性菌群体感应系统的生理学功能
• 3 其它信号分子介导的群体感应系统
• 3.1 AI-2信号分子
• 3.2 其它信号分子
• 4 细菌群体效应研究的意义及展望
• 二 哈密瓜果斑病菌的危害、生物学和控制
• 1.寄主范围和分布
• 2.危害与症状特点
• 3.防治
• 3.1.加强进口检疫,杜绝带菌种子进入我国和传播蔓延
• 3.2.合理的灌溉方式
• 3.3.选育和种植抗病品种
• 3.4.药剂防治
• 第一章 哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应信号分子及致病性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 Acidovorax avenae subsp.citrulli菌株的活化及上清的制备
• 1.2.2 A.tumefacien菌株的活化及prime制备
• 1.2.3 群体感应信号分子检测
• 1.2.4 群体感应信号分子合成酶基因的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 生物显影分析
• 2.2 群体感应信号分子合成酶基因的分析
• 2.3 ACIDOVORAX AVENAE SUBSP.CITRULLI的离体接种试验
• 3 总结与讨论
• 第二章 群体感应系统在哈密瓜细菌性果斑病菌中的功能初探
• 1.材料与方法
• 1.1.试验材料
• 1.1.1.菌株和质粒
• 1.1.2.培养基与抗生素
• 1.1.3.试剂
• 1.2.试验方法
• 1.2.1A.avenae菌株xjL12基因组DNA的提取（Ausubel et al.,1995）
• 1.2.2.DH5α和果斑菌电转化感受态细胞的制备（Samebrook and Russell,2001）
• 1.2.3.质粒DNA小量提取（Samebrook and Russell,2001）
• 1.2.4.aⅱA基因的克隆及序列分析
• 1.2.5.酶切克隆片段与载体质粒的连接
• 1.2.6.重组质粒的电转化
• 1.2.7.亚克隆重组子验证
• 18反相薄层层析'>1.2.8.生物显色及C₁₈反相薄层层析
• 1.2.9.哈密瓜果斑病试验
• 2.结果与分析
• 2.1.AILA基因的克隆及测序
• 2.2.质粒PIQ628构建
• 2.3.菌株XJL12-AⅡA的构建
• 18反相薄层层析分析'>2.4.生物显影及C₁₈反相薄层层析分析
• 2.5.菌株XJL12-AⅡA抑制哈密瓜果斑病害的活性
• 3.总结与讨论
• 第三章 哈密瓜细菌性果斑病菌群体感应信号分子合成基因ACLUXI的敲除及功能分析
• 1.材料和方法
• 1.1.材料
• 1.1.1.菌株和质粒
• 1.1.2.培养基与抗生素
• 1.1.3.试剂
• 1.2.方法
• 1.2.1.Acidovorax avenae subsp.citrulli菌株xjL12基因组DNA的提取
• 1.2.2.大肠杆菌电击感受态的制备
• 1.2.3.电击穿孔转化
• 1.2.4.Acidovorax avenae subsp.citmlli中的acluxI基因的克隆和测序
• 1.2.5.acluxI在基因组中的拷贝数的Southern杂交检测
• 1.2.6.pUC19-acluxI表达载体的构建及其体外表达
• 1.2.7.突变体构建
• 1.2.8.突变体过敏性反应及致病性检测
• 1.2.9.突变体功能互补
• 1.2.10.突变体在NB中的生长情况测定
• 2.结果
• 2.1.ACLUXI基因的克隆和鉴定
• 2.2.AC.AVENAE中的LUXI同源基因的鉴定
• 2.3.ACLUXI在基因组中的拷贝数
• 2.4.PBBR-LUXI表达载体的构建及检测
• 2.4.1.pBBR-luxI表达载体的构建
• 2.5.AC.AVENAE的LUXI突变体的构建
• 2.5.1.pCAM-MCS-luxIud-Km自杀载体的构建
• 2.5.2.Ac.Avenae菌株xjL12的luxI突变体的构建
• 2.5.3.Ac.Avenae菌株XjL12的luxI突变体产生AI-1的情况
• 2.6.突变体过敏反应及致病性检测
• 2.6.1.突变体过敏反应测
• 2.6.2.突变体致病性检灏及互补试验
• 1的游动性测试'>2.7.ACLUXI缺失突变株AC△LUXI₁的游动性测试
• 3.总结与讨论
• 参考文献
• 致谢