肠道菌对苏云金芽胞杆菌家蚕杀虫活性的作用

论文摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一类在土壤中广泛分布的革兰氏阳性细菌,在芽胞形成期可以在菌体内高效表达具有杀虫活性的杀虫晶体蛋白并形成晶体。多年来,研究者们对于Bt的杀虫机制进行了大量的研究,提出了多种模型和假说,但均存在一定的不足和争议,没有一个全面的认识。最近几年,逐渐有一些研究者开始对Bt杀虫中昆虫肠道菌所发挥的作用进行研究,并提出了一些新的证据和观点,即昆虫寄主的肠道共生菌对Bt的杀虫活性存在协同增效或保护作用,但观点并不统一,且其作用机制尚不明了。本文对家蚕肠道共生菌在Bt杀虫中所发挥的作用等方面进行阐述,为阐明肠道共生菌在Bt杀虫中所发挥的作用及最终确定其真正的杀虫机制提供了一定的基础和依据。1.利用可培养的方法对家蚕幼虫肠道优势共生菌进行分离,共得到7株肠道优势共生菌。通过测定生化性状及16S rDNA对其进行鉴定,结果显示7株肠道菌依次为松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、微杆菌属细菌(Microbacterium sp.)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鼠李糖短状杆菌(Brachybacterium rhamnosum),属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)。2.在人工饲料中加入利福霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素等抗生素,筛选对家蚕幼虫生长无影响,又能清除肠道共生菌的抗生素种类和有效浓度。经多次实验确定为利福霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、链霉素各500μg/mL。在灭菌人工饲料中加入此浓度抗生素混合物后饲喂家蚕,用可培养和非可培养方法均检测不到家蚕肠道共生菌,且对幼虫的生长无明显的不良影响。3.以苏云金芽胞杆菌Cry 1 Ac毒素对无肠道共生菌家蚕幼虫进行生物测定,结果显示Cry毒素(浓度为1.411μg/μL)能使无肠道共生菌的家蚕幼虫全部死亡,说明家蚕肠道共生菌对于Bt的杀虫作用不是必需的。之前的一些研究中发现,当以Bt菌株进行生物测定时,鳞翅目昆虫幼虫在生物测定前持续接触抗生素会导致Bt的致病性降低甚至消失。而在本研究中,纯化的Cry毒素对于生物测定前持续接触抗生素的家蚕幼虫仍然完全致病。因此推测Bt菌株在寄主体内的营养生长对其致病性非常重要,Bt致病性降低可能是由于幼虫体内残留的抗生素影响了Bt菌株的生长所致,而不是肠道共生菌缺失的结果。进一步实验结果显示,通过加入抗生素获得的无肠道共生菌家蚕幼虫的LC50值为0.9672μg/μL,而正常饲养、肠道共生菌存在的家蚕幼虫的LC50值为0.4603μg/μL,这说明缺失肠道共生菌后家蚕幼虫对Cry毒素的敏感性明显降低。取食Cry毒素后,存在肠道共生菌的幼虫死亡速度也明显比无肠道共生菌的幼虫快,并且二者最终的死亡率相差约20%。推测产生这些结果的原因,一是家蚕肠道中可能存在某种对Bt杀虫具有增效作用的共生菌,这种微生物自身或者产生的某种物质能增强Bt的毒力；二是昆虫取食Cry毒素后可能使其肠道环境发生变化,干扰了肠道中的正常菌群,从而使某些良性细菌产生致病效应,导致死亡率升高。4.在无肠道共生菌的家蚕幼虫中重建一种土著肠道菌BMB1后,幼虫对Cry毒素的敏感性显著提高,死亡率增加了约40%。统计存在Cry毒素和无Cry毒素条件下幼虫肠道中BMB1的数量,分别为2.4×107 cfu/gut和1.1×107 cfu/gut,表明家蚕幼虫取食Cry毒素后会导致BMB1明显的增殖,其数量约为正常条件下的2倍。这些结果表明BMB1可能对Bt杀虫具有增效作用,而它在Cry毒素存在条件下的增殖可能与其增效作用有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白
• 1.2.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类及杀虫谱
• 1.2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构和功能
• 1.2.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的杀虫机制
• 1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫的增效途径
• 1.3.1苏云金芽胞杆菌产生的增效物质
• 1.3.2 苏云金芽胞杆菌杀虫的其他增效途径
• 1.3.2.1 选育高效菌株
• 1.3.2.2 苏云金芽胞杆菌与其它杀虫剂的混合使用
• 1.3.2.3 化学添加剂对苏云金芽胞杆菌杀虫的增效作用
• 1.3.2.4 植物次生化合物对苏云金芽胞杆菌杀虫的增效作用
• 1.3.2.5 昆虫取食刺激剂对苏云金芽胞杆菌杀虫的增效作用
• 1.3.2.6 提高苏云金芽胞杆菌毒素抗紫外线能力
• 1.4 昆虫肠道共生菌
• 1.4.1 昆虫肠道中的优势菌群
• 1.4.2 肠道菌对昆虫的作用
• 1.4.3 肠道菌对苏云金芽胞杆菌杀虫的作用
• 1.4.3.1 肠道菌的协同作用
• 1.4.3.2 肠道菌的保护作用
• 1.5 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 PCR引物
• 2.1.3 培养基及人工饲料
• 2.1.4 供试昆虫
• 2.1.5 试剂与仪器
• 2.1.5.1 试剂
• 2.1.5.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 家蚕幼虫的饲养
• 2.2.2 家蚕幼虫肠道菌的分离及鉴定
• 2.2.2.1 肠道菌的分离
• 2.2.2.2 肠道菌的菌体形态、培养性状及生化测定
• 2.2.2.3 肠道菌的16S rDNA鉴定
• 2.2.3 家蚕无菌幼虫的获得
• 2.2.3.1 蚕卵表面消毒
• 2.2.3.2 无菌幼虫的饲育
• 2.2.4 家蚕无菌幼虫肠道菌的检测
• 2.2.4.1 可培养方法
• 2.2.4.2 不可培养方法
• 2.2.5 家蚕幼虫的生物测定
• 2.2.5.1 菌株的培养
• 2.2.5.2 生物测定毒素蛋白样品的制备
• 2.2.5.3 生物测定毒素蛋白样品的含量测定
• 2.2.5.4 生物测定毒素蛋白样品的SDS-PAGE
• 2.2.5.5 Cry毒素对家蚕幼虫的生物测定
• 2.2.6 Cry毒素对肠道菌增殖的影响
• 2.2.7 肠道菌对Cry毒素杀虫活性的影响
• 3 结果与讨论
• 3.1 家蚕肠道优势共生菌的分离
• 3.2 家蚕肠道菌的鉴定
• 3.2.1 家蚕肠道菌的生化测定
• 3.2.2 家蚕肠道菌的16S rDNA鉴定
• 3.2.3 系统发育分析
• 3.3 无肠道共生菌家蚕幼虫的获得
• 3.3.1 抗生素种类及浓度筛选
• 3.3.2 筛选抗生素对家蚕幼虫生长的影响
• 3.4 家蚕幼虫的生物测定
• 3.4.1 家蚕幼虫生物测定毒素蛋白样品的制备
• 3.4.2 家蚕幼虫生物测定毒素蛋白样品的SDS-PAGE
• 3.4.3 家蚕幼虫的生物测定
• 3.4.4 肠道菌对Cry毒素杀虫速度的影响
• 3.5 肠道菌对Cry毒素杀虫活性的影响
• 3.6 Cry毒素对肠道菌增殖的影响
• 3.7 小结与讨论
• 参考文献
• 致谢