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Wnt/β-catenin信号通路在猪ADSCs向脂肪细胞分化中的作用及机理研究

2020-11-28阅读(433)

Wnt/β-catenin信号通路在猪ADSCs向脂肪细胞分化中的作用及机理研究

论文摘要

脂肪组织过度发育,在畜牧上造成动物产品胴体品质下降,在人类则表现为肥胖并引发其他相关疾病如糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、高血压、高脂血症等。脂肪组织主要由脂肪细胞组成。脂肪细胞过度增殖、分化是导致体脂过度沉积的直接原因。脂肪细胞起始于中胚层多能干细胞,其分化过程为:多能干细胞—前体脂肪细胞—成熟脂肪细胞。过去30年里,利用已建立的鼠源性3T3-L1前体脂肪细胞系,人们发现了调控前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的各种转录因子,并对这些转录因子做了深入研究,但有关多潜能干细胞向前体脂肪细胞分化的研究较少。另外,随着后基因组信息学的发展,人们发现脂肪细胞分化的各种转录因子活性的启动并不是独立事件,而是受多种相同或者不同的细胞内、外因子及信号通路调控的过程。Wnt/β-catenin是新发现的调控脂肪细胞分化的重要通路。在此通路中,β-catenin蛋白对信号传递起关键作用。激活此通路可以抑制3T3-L1前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化。由于β-catenin及某些Wnt蛋白在3T3-L1前体脂肪细胞分化的早期高表达,因此,推测Wnt/β-catenin通路可能在多能干细胞向脂肪细胞分化中也起作用,但其具体作用及机制目前尚未见报道。猪是重要的肉用家畜,也是脂肪蓄积能力最强的动物之一,是研究脂肪组织形成与发育较为理想的动物模型。本文以猪脂肪间充质干细胞（ADSCs）为细胞材料,利用SQ RT-PCR、Western Blotting技术检测了Wnt/β-catenin信号通路主要成员在猪ADSCs向脂肪细胞分化过程中的时序表达情况;用Wnt/β-catenin信号通路的激活剂—LiCl处理猪ADSCs,并将细胞置于成脂诱导剂中培养,利用细胞免疫荧光染色、细胞油红O染色及油红O染色提取法、SQ RT-PCR及Western Blotting等技术研究了激活Wnt/β-catenin信号通路对猪ADSCs向脂肪细胞分化的作用及其机制;采用基因重组技术构建了Wnt/β-catenin通路的第二信使—β-catenin的逆转录病毒干扰载体并稳定转染猪ADSCs;利用细胞油红O染色及油红O染色提取法、SQ RT-PCR及Western Blotting等技术分析了阻断Wnt/β-catenin信号通路对猪ADSCs向脂肪细胞分化的影响。同时,采用“天花板”培养法获得猪去分化的前体脂肪细胞,利用细胞油红O染色、RT-PCR等方法检测了传代后前体脂肪细胞分化能力,并对这种前体脂肪细胞进行了细胞生物学鉴定。获得的主要研究结果如下:1.激活Wnt/β-catenin信号通路抑制了猪ADSCs向脂肪细胞分化的能力。LiCl增加了细胞内β-catenin蛋白的表达量,说明Wnt/β-catenin信号通路被激活;激活Wnt/β-catenin信号通路后,油红O染色的细胞数目减少,细胞内脂肪含量降低,而ADSCs向成骨细胞分化的能力增强;脂肪转录因子C/EBPα和PPARγ的表达受到抑制,而C/EBPβ和C/EBPδ等转录因子的表达未发生改变。2.阻断Wnt/β-catenin信号通路促进了猪ADSCs向脂肪细胞分化的潜能。敲除β-catenin后ADSCs向脂肪细胞分化的比例增加,细胞内脂肪含量升高,C/EBPα和PPARγ表达水平提高,并抑制了LiCl的抗脂肪细胞分化的作用。3.生理状态下,Wnt/β-catenin信号通路中的主要成员Wnt10,Frizzled1/2, GSK3β,β-catenin等基因在猪ADSCs中及ADSCs向脂肪细胞分化的早期均高表达,但随着成脂分化的进行表达量逐渐减少。4.成功构建了β-catenin的逆转录病毒干扰载体pSuper- retro-β-catenin shRNA,并将其转染到猪ADSCs中,经过嘌呤霉素筛选得到了稳定敲除β-catenin基因的细胞。5.分离、纯化得到猪ADSCs,经鉴定95%以上的ADSCs表达成体干细胞标志CD44和CD105;ADSCs在不同诱导剂中可分化成成骨、脂肪和成肌等细胞,具有多向分化潜能。6.成熟脂肪细胞可以去分化为前体脂肪细胞,传代后的前体脂肪细胞与原代培养的脂肪基质微管细胞（SVF）一样,有正常的增殖能力、可重新分化成脂肪细胞,但纯度和成脂分化率高于SVF。这种前体脂肪细胞冻存前后遗传性能良好,是一种很好的前体脂肪细胞模型。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 文献综述
  • 第一章 脂肪细胞分化与相关信号通路
  • 1.1 脂肪细胞来源及分化历程
  • 1.1.1 多潜能干细胞
  • 1.1.2 脂肪母细胞
  • 1.1.3 前体脂肪细胞
  • 1.1.4 成熟脂肪细胞
  • 1.2 转录因子与脂肪细胞分化
  • 1.2.1 PPAR 家族
  • 1.2.2 C/EBP 家族
  • 1.2.3 ADD-1
  • 1.3 信号通路与脂肪细胞分化
  • 1.3.1 INSULIN/IGF-1 信号转导与脂肪细胞分化
  • 1.3.2 MAPK 通路与脂肪细胞分化
  • 1.3.3 TGFΒ/BMPS 信号转导与脂肪细胞分化
  • 1.3.4 FGFS 信号与脂肪细胞分化
  • 1.3.5 WNT 信号通路与脂肪细胞分化
  • 1.3.6 SHH 通路与脂肪细胞分化
  • 第二章 WNT /Β-CATENIN 信号通路概述
  • 2.1 WNT /Β-CATENIN 信号通路
  • 2.1.1 WNT /Β-CATENIN 信号通路主要成员
  • 2.1.2 WNT/Β-CATENIN 信号通路的发生
  • 2.2 WNT/Β-CATENIN 信号通路与脂肪形成
  • 2.3 WNTS 信号调节脂肪发育的机制
  • 2.3.1 WNT 与其受体、辅助受体
  • 2.3.2 WNT 与脂肪细胞有丝分裂
  • 第三章 脂肪源性干细胞—ADSCS 研究进展
  • 3.1 ADSCS 的发现
  • 3.1.1 ADSCS 优点及分子标记
  • 3.1.2 ADSCS 多向分化潜能
  • 3.2 ADSCS 应用潜力及需要解决的问题
  • 实验研究
  • 前言
  • 第四章 猪ADSCS 的分离及诱导分化
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 实验材料
  • 4.1.2 实验方法
  • 4.2 结果
  • 4.2.1 猪ADSCS 培养特性与纯化
  • 4.2.2 猪ADSCS 多向分化潜能鉴定结果
  • 4.3 讨论
  • 4.4 小结
  • 第五章 WNT/Β-CATENIN 信号通路各因子在ADSCS 成脂分化过程中的表达分析
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 实验材料
  • 5.1.2 实验方法
  • 5.2 结果
  • 5.2.1 猪ADSCS 成脂诱导后细胞油红O 染色形态观察
  • 5.2.2 猪ADSCS 向脂肪细胞分化过程中WNT/Β-CATENIN 信号各因子时序表达
  • 5.3 讨论
  • 5.3.1 多能干细胞定向脂肪细胞分化过程
  • 5.3.2 WNT/Β-CATENIN 信号在脂肪细胞分化过程中的表达
  • 5.4 小结
  • 第六章 激活WNT/Β-CATENIN 通路通路对ADSCS 向脂肪细胞分化的影响
  • 6.1 材料与方法
  • 6.1.1 实验材料
  • 6.1.2 实验方法
  • 6.2 结果
  • 6.2.1 LICL 增加了猪ADSCS 细胞内Β-CATENIN 蛋白的表达
  • 6.2.2 激活WNT/Β-CATENIN 信号通路抑制ADSCS 成脂分化
  • 6.2.3 LICL 处理过程中脂肪转录因子表达变化
  • 6.2.4 激活WNT/Β-CATENIN 信号通路促进ADSCS 向成骨细胞分化
  • 6.3 讨论
  • 6.3.1 激活WNT/Β-CATENIN 信号通路与脂肪细胞分化
  • 6.3.2 WNT/Β-CATENIN 信号通路调控脂肪形成的机制
  • 6.4 小结
  • 第七章 Β-CATENIN 逆转录病毒干扰表达载体的构建
  • 7.1 材料与方法
  • 7.1.1 材料
  • 7.1.2 实验方法
  • 7.2 结果
  • 7.2.1 PSUPER-RETRO-PURO 载体成功扩繁
  • 7.2.2 PSUPER-RETRO-PURO-Β-CATENIN 干扰载体的成功构建
  • 7.3 讨论
  • 7.3.1 RNAI 技术的发展
  • 7.3.2 RNAI 技术在脂肪细胞中的应用
  • 7.4 小结
  • 第八章 敲除Β-CATENIN 对猪ADSCS 向脂肪细胞分化的影响
  • 8.1 材料与方法
  • 8.1.1 材料
  • 8.1.2 实验方法
  • 8.2 结果
  • 8.2.1 嘌呤霉素最佳致死浓度的筛选
  • 8.2.2 Β-CATENIN 干扰载体稳定转染至细胞
  • 8.2.3 敲除Β-CATENIN 对猪ADSCS 成脂分化的影响
  • 8.2.4 敲除Β-CATENIN 后对C/EBPΑ和PPARΓ基因表达的影响
  • 8.3 讨论
  • 8.3.1 提高猪ADSCS 转染效率
  • 8.3.2 细胞内敲除Β-CATENIN 相关研究
  • 8.4 小结
  • 第九章 猪前体脂肪细胞系的初步研究
  • 9.1 材料与方法
  • 9.1.1 实验材料
  • 9.1.2 实验方法
  • 9.2 结果
  • 9.2.1 成熟脂肪细胞去分化为前体脂肪细胞
  • 9.2.2 传代后前体脂肪细胞的分化
  • 9.2.3 传代后细胞活力检测及倍增时间
  • 9.2.4 去分化前体脂肪细胞核型分析
  • 9.2.5 微生物学检测结果
  • 9.3 讨论
  • 9.3.1 细胞系的概念及建立标准
  • 9.3.2 有关前体脂肪细胞培养模型
  • 9.3.3 去分化前体脂肪细胞系的研究
  • 9.4 小结
  • 结论
  • 创新点
  • 进一步研究内容
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 缩略词表

    • 相关论文文献

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