根癌农杆菌LBA4404介导的微紫青霉菌菌株GXCR遗传转化体系的建立

论文摘要

从基因水平来研究丝状真菌与重金属间的相互作用具有重要的意义，近年来发展的根癌农杆菌介导的遗传转化（ATMT）与传统的遗传转化方法相比较，ATMT具有高效、稳定、高频单拷贝随机插入、适用范围广等优点，是目前研究丝状真菌遗传转化的主要手段之一。基于本实验室工作曾分离得到一株高抗多种重金属盐并对苯菌灵敏感的微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR的良好基础，研究将建立由根癌农杆菌LBA4404介导的GXCR菌株的遗传转化体系，为从基因水平上研究该菌株对重金属盐抗性的可能机制提供基础。本研究在质粒pGSA1252基础上构建了T-DNA区含有苯菌灵抗性基因（Benomylresistance）的双元载体pG-Bn，通过三亲转化法导入到根癌农杆菌LBA4404中，与稀释至107个／ml的GXCR孢子共培养两天后筛选得到具有苯菌灵抗性的转化株367株，对随机挑取的40株转化株总DNA进行PCR验证，有98％的转化株均能扩增出目的片段，转化效率达到了3．7个转化株／10个小菌块。随机挑选30个能扩增出目的片段的转化株中，有13个转化株不能在CuSO4PDA平板上生长，9个转化株的生长明显受CuSO4抑制。同时对表型明显发生变化的转化株总DNA进行Southern杂交分析，结果显示62．5％的转化株为T-DNA单拷贝整合插入，易于利用插入突变来分析相关基因的功能，为对微紫青霉菌菌株GXCR的抗重金属遗传机制的研究提供了宝贵的材料。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 丝状真菌与重金属的相互作用
• 1.1.1 重金属污染现状
• 1.1.2 重金属污染的特点
• 1.1.3 重金属与丝状真菌的相互作用
• 1.2 丝状真菌遗传转化方法的研究进展
• 2/PEG介导的原生质体（Protoplasts/PEG）转化法'>1.2.1 CaCl₂/PEG介导的原生质体（Protoplasts/PEG）转化法
• 1.2.2 电穿孔（Electroporation）转化法
• 1.2.3 醋酸锂（Lithium Acetate）转化法
• 1.2.4 转座子标签技术（Transposon tagging）
• 1.2.5 脂质体（Liposome）转化法
• 1.2.6 基因抢（Biolistics）转化法
• 1.2.7 限制性酶介导插入突变转化法（Restriction enzyme-mediated insertional,REMI）
• 1.2.8 激光（Laser）诱导融合法
• 1.2.9 根癌农杆菌介导的转化法（Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation.ATMT）
• 1.3 根癌农杆菌介导遗传转化体系的原理和优点
• 1.3.1 根癌农杆菌介导的遗传转化体系的主要原理
• 1.3.2 根癌农杆菌介导的遗传体系的优点
• 1.4 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的应用
• 1.4.1 利用基因敲除研究基因功能
• 1.4.2 利用基因插入突变标记克隆相关基因
• 1.5 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和载体质粒
• 2.1.2 抗生素及使用浓度
• 2.1.3 培养基及其各菌株培养条件
• 2.1.4 使用试剂
• 2.1.5 溶液与缓冲液
• 2.1.6 实验中用到的主要仪器与设备
• 2.1.7 本实验所用到的引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒DNA的提取
• 2.2.2 DNA的酶切反应
• 2.2.3 DNA片段的回收
• 2.2.4 DNA的连接反应
• 2.2.5 质粒DNA的热击转化
• 2.2.6 PCR反应
• 2.2.7 PCR产物回收
• 2.2.8 PCR产物的克隆
• 2.2.9 DNA的测序
• 2.2.10 三亲结合法将构建好的载体导入根癌农杆菌LBA4404
• 2.2.11 根癌农杆菌质粒DNA的提取
• 2.2.12 冻融法将重组质粒DNA导入根癌农杆菌LBA4404
• 2.2.13 根癌农杆菌Ti质粒介导的转化
• 2.2.14 微紫青霉菌（Penicillium janthinillum）菌株GXCR转化株总DNA的提取
• 2.2.15 转化株总DNA的PCR验证
• 2.2.16 转化株的遗传稳定性检测
• 2.2.17 转化株的抗重金属能力变化分析
• 2.2.18 Southern杂交
• 第三章 结果与分析
• 3.1 载体的构建
• 3.1.1 载体、质粒的酶切位点分析和引物的获得
• 3.1.2 抗苯菌灵基因片段的获得
• 3.1.3 抗苯菌灵基因片段连接到中间载体pGEM-3zf（+）
• 3.1.4 将抗苯菌灵基因片段连接到表达载体pGSA1252
• 3.1.5 将构建好的双元载体导入根癌农杆菌LBA4404中
• 3.2 根癌农杆菌介导微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR转化体系的建立
• 3.2.1 含有构建好的双元载体的根癌农杆菌LBA4404与微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR孢子的共培养
• 3.2.2 转化突变株的筛选结果
• 3.2.3 转化株总DNA的PCR验证
• 3.2.4 转化株稳定性检测
• 4的抗性能力分析'>3.2.5 转化突变株对硫酸铜CuSO₄的抗性能力分析
• 3.2.6 转化株Southern杂交分析
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间论文发表情况