论文摘要
目的:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以关节滑膜增生、关节软骨侵蚀破坏为特征的全身性、炎性自身免疫性疾病,迄今尚无根治疗法。研究表明,RA患者比普通人群病死率增高70%,其中35～50%为心血管疾病所致,心血管疾病尤其是快速发展的动脉粥样硬化是RA患者的首要死亡原因。多种炎症介质及炎性细胞参与了RA患者长期慢性的炎症性反应,导致一系列致动脉粥样硬化的代谢功能改变。这些代谢紊乱之间相互作用,最终促使RA患者动脉粥样硬化加速进展。在这些炎症介质中,新近发现的细胞膜表面粘附分子CD147日益受到了人们广泛的关注。CD147分子,又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导剂（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN）,在多种肿瘤细胞和组织中高表达,通过诱导成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）促进了肿瘤的侵袭和转移。研究表明,CD147在RA患者滑膜以及外周血和滑液中的各种炎细胞表面均有较高表达,在RA的病理损伤中起到了重要的作用。此外,在人动脉粥样硬化斑块及纤维帽中,CD147、MMP亦有高表达,推测CD147在人动脉粥样硬化中可能通过诱导活化MMP促进组成纤维帽的细胞外基质降解,强度减小,导致斑块纤维帽变薄破裂。因此,CD147可能在动脉粥样硬化的过程中发挥了重要作用。新近研究发现,氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）可以促进细胞膜表面CD147 （ membrane CD147 , mCD147 ）从心脏冠状动脉平滑肌细胞（HCA-SMCs）表面脱落,并以可溶性的形式（soluble CD147,sCD147）继续发挥其生物学效应,加速动脉粥样硬化的发生。本实验室先前工作发现,CD147可以从外周血单核细胞（PBMo）表面脱落或被直接分泌进入外周血或关节液中,提示sCD147可能参与RA关节损伤与发病。为了深入研究sCD147与RA患者动脉粥样硬化发生和进展的相关性,全面评价RA动脉粥样硬化的危险因素,探讨在免疫调节的基础上进行治疗性干预,从而预防RA患者心血管事件的发生。本课题旨在:①检测RA患者外周血中sCD147的含量并与其血脂水平进行相关性分析;②建立单核（Mo）/巨噬细胞（Mac）来源的泡沫细胞模型,研究:CD147在U937-Mo源性泡沫细胞膜表面的动态表达;CD147在分化中的Mo/Mac及泡沫细胞中表达的变化;泡沫细胞的形成对MMP-2, 9合成的影响;③RA、冠心病患者和健康对照的Mac源性泡沫细胞的mCD147/sCD147表达对ox-LDL浓度的依赖性;sCD147对心脏成纤维细胞（HCF）合成MMP-2, 9的影响及CD147拮抗剂AP-9的抑制作用。方法:1.采用ELISA检测RA、冠心病患者及健康对照血清中sCD147含量,分析sCD147水平与RA患者病情活动度（DAS28）的相关性;以全自动生化分析仪测定RA患者血脂水平,分析血清中sCD147与血脂水平的相关性。2.分离RA、冠心病患者及健康对照PBMo,以GM-CSF刺激分化为Mac后,分别加不同浓度ox-LDL作用48h,建立PBMo-Mac源性泡沫细胞模型;将PMA诱导分化前、后的U937细胞加入不同浓度ox-LDL作用48h,建立U937-Mo/Mac源性泡沫细胞模型,并通过高效液相色谱法及油红“O”特殊染色鉴定泡沫细胞。3.将U937-Mo细胞分别在不同浓度的ox-LDL条件下培养48h,收集细胞;将U937-Mo细胞与80mg/L ox-LDL共培养,于不同时间点收集细胞。采用流式细胞术,RT-PCR检测CD147及其mRNA在U937-Mo源性泡沫细胞中的表达与ox-LDL浓度及培养时间的依赖性。4. U937细胞在PMA诱导下分化7天后,与不同浓度ox-LDL作用48h,使之成为U937- Mac源性泡沫细胞。采用流式细胞术及RT-PCR检测CD147在单核细胞分化过程中和泡沫细胞膜表面的表达及其mRNA水平;采用ELISA、western blotting、明胶酶谱检测不同浓度ox-LDL对泡沫细胞产生sCD147及MMP-2, -9的影响。5.选取15例RA患者、17例冠心病患者及12例健康对照,分离其PBMo,经GM-CSF诱导分化为巨噬细胞后,与不同浓度ox-LDL作用48h建立泡沫细胞模型。采用流式细胞术,western blotting检测泡沫细胞mCD147的表达; ELISA,western blotting检测相应细胞培养上清中sCD147的表达; RT-PCR检测泡沫细胞中CD147 mRNA的表达;明胶酶谱、RT-PCR检测ox-LDL （100mg/L）与巨噬细胞作用48h后,细胞培养上清+心脏成纤维细胞（HCF）、细胞上清+HCF+AP9、HCF等三组细胞MMP-2,9的表达以及CD147拮抗剂AP-9对MMP-2, 9产生的抑制作用。结果:1.RA患者血清中sCD147水平显著高于冠心病患者及健康人（P<0.05）,且病情高度活动RA组其sCD147水平显著高于病情低度活动组及中度活动组（P<0.05）。总胆固醇（TC）升高组及甘油三酯（TG）升高组RA患者的TC/TG水平与其血清中sCD147水平呈正相关（r=0.84,P<0.05;r=0.87,P<0.05）,而TC轻度升高及正常组或TG正常组患者的TC/TG水平则与其血清中sCD147水平无相关性（r=0.41,P=0.21;r=0.14,P=0.57;r=0.49,P=0.87）;低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高及轻度升高组RA患者的LDL-C水平与其血清中sCD147含量呈正相关（r=0.86,P<0.05;r=0.81,P<0.05）,LDL-C正常组两者则无相关性（r=0.78,P=0.22）;RA患者高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平与其血清中sCD147水平无相关性（r=0.04,P=0.96;r=0.13,P=0.87）。2.未吞噬ox-LDL的细胞内胆固醇酯约占总胆固醇的15.52%,吞噬后约占细胞内总胆固醇的60%以上,符合泡沫细胞生物学特征。吞噬组细胞经油红“O”特殊染色后,光镜下可见胞浆呈泡沫样改变,并有红染颗粒,表明脂质染色阳性。建立的泡沫细胞模型在生物和形态学上均符合泡沫细胞的定义。3.ox-LDL浓度和作用时间动态分析:CD147表达高峰的浓度为25 mg/L;固定ox-LDL浓度为80mg/L时,CD147表达高峰的作用时间为6h;而CD147mRNA表达高峰时ox-LDL作用浓度及时间分别为25 mg/L、6小时,此后其mRNA水平不变。4. U937细胞在PMA诱导后的第1,3 d, mCD147平均荧光强度（MFI）较诱导前显著升高（P<0.05）;但在第5,7d,mCD147较诱导前显著降低（P<0.05）;U937细胞经PMA诱导分化的7天中,CD147mRNA水平较分化前升高约4～6倍（P<0.05）。随着ox-LDL作用浓度增加,泡沫细胞mCD147 MFI较作用前呈逐渐减弱趋（P<0.05） ;同步采用western blotting及ELISA检测显示,细胞培养上清中sCD147水平较作用前呈逐渐上升趋势（P<0.05）。在此过程中,CD147mRNA表达不变。随着ox-LDL浓度增加,泡沫细胞MMP-2 , 9的分泌及活性逐渐增强。5.流式细胞术及western blotting结果显示,随着ox-LDL作用浓度的增加,泡沫细胞mCD147表达较作用前呈逐渐减弱趋势（P<0.05）;同步ELISA和western blotting检测结果显示,细胞培养上清中sCD147含量较作用前呈逐渐上升趋势（P<0.05）,且分子量与细胞膜表面相近;上述减弱和上升趋势由强到弱分别RA、冠心病患者,健康对照,但在此过程中泡沫细胞CD147 mRNA的水平无变化。明胶酶谱及RT-PCR结果表明,富含sCD147的细胞培养上清与HCF共培养后可促进后者MMP-2,9的合成, CD147拮抗剂AP-9可以部分抑制这种促进作用。结论:1.RA患者体内sCD147分子可能参与了RA的发病,且与病情活动度及血脂的异常相关。2.所建立的动脉粥样硬化的病理细胞模型在生物和形态学上均符合泡沫细胞的定义。3.CD147在U937-Mo源性的泡沫细胞膜表面表达升高;短时间、低浓度ox-LDL促进CD147表达;泡沫细胞中CD147 mRNA水平与ox-LDL的作用浓度及时间无关。4.CD147可能仅维持单核细胞向巨噬细胞分化时的表达水平,并可能足以使分化的巨噬细胞在其成熟期执行特殊功能;ox-LDL促进泡沫细胞合成MMP-2, 9。5.ox-LDL可能通过促进分化后的RA PBMo释放sCD147;sCD147促进HCF合成MMP-2, 9;CD147拮抗剂AP-9可以抑制这种促进作用。