论文题目: 甘薯茎线虫病抗性的分子标记及相关基因片段的克隆
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 柳哲胜
导师: 刘庆昌
关键词: 甘薯,茎线虫病,分子标记,基因克隆
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究以高抗甘薯茎线虫病品种徐78-1和高感茎线虫病品种徐薯18的杂交F1代分离群体为材料,对甘薯抗茎线虫基因进行分子标记研究。通过遗传分析推测甘薯茎线虫病抗性受单基因控制。采用BSA（bulk segregant analysis）法和SRAP（sequence-related amplification polymorphism）技术对甘薯抗茎线虫病基因进行分子标记研究,用抗感基因池共筛选了200对SRAP引物,得到能在抗感基因池之间扩增出多态性带的引物组合77对。选取其中的62对引物用分离群体进行鉴定,共获得4个与抗病基因连锁的分子标记,其中引物组合A9B4找到3个标记,分别命名为Nsp1、Nsp2和Nsp3,与抗茎线虫基因的遗传距离分别为4.71cM、4.71cM和6.32cM;引物组合A3B6找到了1个标记,命名为Nsp4,与抗茎线虫基因的遗传距离为8.73cM。 甘薯新品系农大603是从感茎线虫病品种徐薯18的辐照后代中获得的一个抗茎线虫病的突变体。根据已报道的植物线虫抗性基因的核苷酸结合位点（NBS）保守氨基酸序列设计兼并引物,用RGAP（resistance gene analog polymorphisms）技术及自行改进的SSAP（modified sequence-specific amplification polymorphisms）方法,对农大603和徐薯18的基因组进行PCR扩增,从农大603中扩增出含有植物抗病基因NBS保守序列的差异片段4个（片段58、片段54、片段72和片段77）。在Genbank上序列搜索和比对发现,克隆序列与已报道的植物抗病基因之间同源性较低。根据克隆片段的DNA序列设计引物,以抗、感茎线虫病的甘薯品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增,结果显示由片段58、片段72和片段77设计的引物在抗、感品种上没有扩增出多态性带;由片段54设计的引物在抗病品种和感病品种之间扩增出多态性带,认为片段54可能是与甘薯抗茎线虫病有关的RGA。 根据片段54的序列设计特异引物P54,同时根据其它植物线虫抗性基因的NBS保守氨基酸序列设计1个兼并引物P2,对农大603和徐薯18的块根mRNA进行RT-PCR扩增,获得一个大小483bp基因片段,该基因在农大603上的表达量明显高于徐薯18。同源性比较发现,该基因片段与其它植物肌醇-1-磷酸合成酶（Myo inositol-1-phosphate synthase,MIPS）基因有较高的同源性。采用3’RACE技术扩增出目的基因的3’末端cDNA。根据植物MIPS基因5’端保守的氨基酸序列设计兼并引物,并与3’端的特异引物组合,扩增出该基因的5’端cDNA序列。所克隆的基因的cDNA全长为1856bp。同源性比较表明,目的基因与其它植物MIPS基因的同源性较高,如与大豆、番茄的MIPS基因DNA序列同源性分别为83.63%和83.89%;氨基酸序列同源性分别为92.16%和90.59%,因此认为所克隆的基因是甘薯MIPS基因,并推测该基因可能与甘薯抗茎线虫病有关。甘薯肌醇-1-磷酸合成酶基因全长cDNA的克隆,有利于进一步研究该基因与甘薯对茎线虫病抗性的关系。
论文目录:
第一章 文献综述
1.1 分子标记的种类及其在植物遗传育种中的应用
1.1.1 分子标记的种类
1.1.2 DNA分子标记在植物遗传育种中的应用
1.2 分子标记在甘薯遗传育种中的应用
1.2.1 甘薯的起源、进化及传播途径
1.2.2 甘薯组植物的分类
1.2.3 构建分子标记连锁图谱
1.2.4 在甘薯遗传育种中的应用
1.3 植物抗病基因的研究进展
1.3.1 植物抗病基因的克隆方法
1.3.2 抗病基因蛋白的保守区域
1.3.3 抗病基因的分类
1.3.4 植物抗线虫基因的克隆
1.4 甘薯茎线虫病及其防治措施
1.4.1 甘薯茎线虫形态和生态特征及致病机理
1.4.2 甘薯茎线虫病的症状
1.4.3 甘薯抗茎线虫病的机理
1.4.4 甘薯茎线虫病的综合防治
1.4.5 甘薯抗茎线虫病育种
1.5 本课题的研究目的和意义
第二章 甘薯茎线虫病抗性基因的分子标记
2.1 材料与方法
2.1.1 植物材料
2.1.2 抗性鉴定
2.1.3 交换值的计算
2.1.4 作图软件为MapManager QTXb17。
2.1.5 BSA(Bulked segregant analysis)分池法
2.1.6 甘薯总DNA的提取
2.1.7 SRAP分析
2.2 结果与分析
2.2.1 F_1分离群体单株抗性鉴定及抗性遗传分析
2.2.2 用抗、感基因池筛选SRAP引物
2.2.3 甘薯抗茎线虫病基因的SRAP标记的建立
2.3 讨论
2.3.1 F_1分离群体单株茎线虫抗性的鉴定
2.3.2 甘薯茎线虫病抗性基因的遗传分析
2.3.3 甘薯抗茎线虫病基因的SRAP分子标记的建立
第三章 甘薯抗茎线虫病相关RGA的克隆
3.1 材料与方法
3.1.1 植物材料
3.1.2 RGAP分析
3.1.3 MSSAP分析
3.1.4 电泳和银染
3.1.5 片段的克隆与测序
3.1.6 数据分析
3.1.7 克隆片段的鉴定
3.2 结果与分析
3.2.1 RGAP分析
3.2.2 MSSAP分析
3.3 讨论
3.3.1 利用RGAP法扩增农大603与徐薯18的差异RGA
3.3.2 利用MSSAP法扩增农大603与徐薯18的差异RGA
第四章 甘薯肌醇-1-磷酸合成酶基因的克隆与序列分析
4.1 材料与方法
4.1.1 植物材料
4.1.2 甘薯块根总RNA的提取
4.1.3 引物设计
4.1.4 RT-PCR的cDNA第一链合成
4.1.5 RT-PCR
4.1.6 3’末端cDNA库的构建
4.1.7 5’末端cDNA库的构建
4.1.8 3'RACE
4.1.9 5’端cDNA的PCR扩增
4.1.10 肌动蛋白(actin)基因的RT-PCR
4.1.11 PCR产物克隆、鉴定和测序
4.1.12 数据分析
4.2 结果与分析
4.2.1 RT-PCR
4.2.2 3'RACE
4.2.3 目的基因5’端cDNA片段的PCR扩增
4.2.4 5’和3’端cDNAPCR产物的克隆、测序、拼接和序列分析
4.2.5 DNA序列和氨基酸序列的同源性比较
4.3 讨论
4.3.1 甘薯MIPS基冈cDNA全长的克隆
4.3.2 3'RACE技术的改进
第五章 结论
参考文献
附表
个人介绍
发布时间: 2005-07-18
参考文献
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- [6].湖南甘薯品种遗传多样性分析[D]. 张超凡.中南大学2010
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