论文摘要
猪囊尾蚴病是全球性寄生性蠕虫病,发展中国家更为常见,尤其在我国,该病的流行给人民生产和生活带来诸多危害,给人类的健康带来严重的影响。我国至少已有31个省（市、自治区）有过该病的报道,囊尾蚴病患者约1000万,每年屠宰的囊尾蚴病猪约1200万头,直接经济损失约20亿元。脑囊尾蚴病对人类的健康危害极大,在某些发展中国家,脑囊尾蚴病是引起人死亡的主要原因之一。由于抗药性的不断出现以及药物残留等问题的严重性,使得利用免疫预防技术来取代药物成为控制猪囊尾蚴病的必然。免疫毒素是一种导向药物,它将毒素基因和靶向基因融合,表达融合蛋白,具有识别和选择性地破坏受体靶细胞的功能,它由导向部分和毒性部分组成。绿脓杆菌外毒素通常作为重组毒素的毒性成分,其毒性本质是它能够催化真核细胞延伸因子的ADP核糖基化,阻止肽链延长并中断细胞蛋白质的合成而行使细胞毒作用。作为重组毒素的导向部分,除能够与特定靶细胞表面受体结合外,同时能够与毒素基因相融合,表达出融合蛋白,且二者不影响各自独立结构和功能。将猪囊尾蚴头节单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素PE40基因连接,装入表达载体pET-28（a）中,以获得重组毒素,研究其对猪囊尾蚴的杀灭作用。从绿脓杆菌ATCC27853菌株中提取基因组,根据GenBank发表的绿脓杆菌外毒素基因全序列,自行设计引物,分别引入XbaⅠ和HindⅢ酶切位点。采用PCR方法扩增PE40基因,在反应体系中加入10%总体积的甘油,电泳检测,纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接构建质粒pMD18-T-PE40,转入大肠杆菌感受态JM109中,蓝白斑筛选阳性克隆菌,提取质粒进行酶切鉴定及PCR鉴定,并测序。质粒pMD18-T-PE40经XbaⅠ和HindⅢ双酶切后电泳显示2692bp和1083bp两条带,测序结果显示扩增的PE40基因共有10个碱基发生改变,变异的碱基引起7个氨基酸发生变化,但PE40肽段的重要活性位点与绿脓杆菌标准产毒株PA103相比均未发生变化。含有ScFv基因的质粒pMD18-T-ScFv已经构建,且ScFv基因两端的酶切位点分别为EcoRⅠ和XbaⅠ,用XbaⅠ和HindⅢ分别对质粒pMD18-T-PE40和pMD18-T-ScFv进行双酶切,利用XbaⅠ和HindⅢ酶切位点将PE40基因与质粒pMD18-T-ScFv相连接,转入大肠杆菌感受态JM109中,挑取阳性菌酶切鉴定。经酶切电泳分析,得到大小约为1800bp的目的片段,与预期结果相同,说明ScFv与PE40已连接成功。用EcoRⅠ和HindⅢ分别对重组质粒pMD18-T-ScFv-PE40和表达载体pET-28（a）进行酶切,将ScFv-PE40转入pET-28（a）表达载体中构建融合毒素pET28-ScFv-PE40,转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中,挑取阳性菌落提取质粒,酶切电泳检测,得到目的条带大小约为1800bp,保存菌种,为进一步研究重组免疫毒素对猪囊尾蚴的杀灭作用奠定基础。