论文摘要
背景和目标:p53在很多细胞凋亡信号通路中都扮演着十分重要的角色,包括膜凋亡信号,线粒体凋亡通路,并影响着很多与凋亡相关因子的转录与表达。细胞受到紫外光照射、电离辐射、毒性化合物或其他环境损伤后,会发生DNA断裂,此时p53蛋白水平就会增加,并起始保护性措施。ASPP （ Apoptosis Stimulating Protein of p53 or Ankyrin repeat、SH3 domain、Proline-rich domain containing Proteins）蛋白家族包括ASPP1、ASPP2和iASPP。ASPP1,ASPP2能特异地刺激p53及其同族蛋白p63和p73的细胞凋亡功能,iASPP则抑制p53的凋亡功能。许多化疗药物通过损伤DNA诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用,在p53缺失的肿瘤细胞中细胞凋亡是否发生及其与ASPP家族的关系有待深入研究。本实验用β-榄香烯,吡柔比星和顺铂处理p53纯合缺失的K562细胞,观察细胞形态学改变,细胞周期阻滞情况及ASPP1,ASPP2mRNA在用药前后表达的改变,探讨ASPP家族在调节肿瘤细胞化疗反应性方面的作用。方法:以p53纯和缺失的髓细胞白血病细胞系K562为研究对象,应用临床上常规三种抗肿瘤药:β-榄香烯、吡柔比星和顺铂分别作用于K562细胞。用MTT法检测药物抑制率。筛选适宜浓度后,通过电镜观察细胞在药物作用24小时后的形态改变,流式细胞检查细胞周期的阻滞情况。RT-PCR比较ASPP家族mRNA的表达在用药后24小时的变化。结果:1β-榄香烯、吡柔比星和顺铂对K562细胞的作用呈现浓度和时间依赖性。β-榄香烯（50μg/ml）作用后24小时的细胞在光镜下可见细胞碎解,胞膜不完整,细胞核染色质呈块状,边置,以细胞坏死为主,吡柔比星和顺铂组的形态学表现为细胞胞质浓缩,核膜逐渐曲折,包裹浓聚的染色体块,并分散于胞浆之中,呈非典型的凋亡改变。2流式结果显示:β-榄香烯（50μg/ml,25μg/ml）主要使细胞周期阻滞于S期,凋亡率分别为5.66%、4.58%,与电镜中所见的大部分细胞发生坏死,少部分凋亡基本一致。吡柔比星（1.25μmol/l,2.5μmol/l）使细胞周期阻滞于S期,凋亡率分别为11.64%、12.11%。顺铂（1.5μg/ml,3.0μg/ml）使细胞周期阻滞于G1期,凋亡率分别为8.83%、11.45%。3 RT-PCR结果显示:ASPP1、ASPP2mRNA的表达在用药前后没有明显差异（p>0.05）。β-榄香烯组的ASPP1的片段大小在1159bp左右,而对照组与其他用药组ASPP1在580bp左右。各组ASPP2片段在389bp左右。结论:1吡柔比星和顺铂可诱导K562细胞的非p53依赖的凋亡,而β-榄香烯主要引起细胞坏死。2顺铂主要使细胞周期阻滞于G1期,吡柔比星和β-榄香烯主要使细胞周期阻滞于S期。3在p53表达缺陷的K562细胞中,三种抗肿瘤药物对ASPP1、ASPP2mRNA表达没有影响,提示p53的状态可能影响ASPP的转录水平。