昆虫脂肪体细胞体外增殖方法及同源病毒敏感脂肪体细胞系建立研究

论文摘要

昆虫细胞系具有非常广泛而重要的科学和应用价值。本研究参考动物细胞培养中植块培养的方法，从昆虫幼虫脂肪体细胞的原代培养入手，系统研究了以昆虫脂肪体组织为实验材料建立昆虫细胞系的方法，并初步探讨了昆虫细胞在体外增殖的机制，试图为更多昆虫脂肪体细胞系的建立提供有效的技术手段。研究中选用健康的光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）幼虫脂肪体组织为实验材料进行原代培养，通过比较不同虫龄、不同取材部位的大小和完整性、不同培养表面、不同培养液种类和pH、不同血液中酚氧化酶原抑制物的种类和添加比例、原代培养物的贴壁处理等因素对原代培养结果的影响，以及传代方式、条件、时机等对传代培养结果的影响，试图探索出一套特有的昆虫脂肪体细胞建系方法。实验结果表明，由脂肪体组织建立昆虫细胞系，最佳的取材为末龄或进入预蛹期幼虫体内完整的脂肪体组织，优先使用一次性塑料培养瓶，原代细胞培养液的最佳配制比例为：TNM-FH（80％），胎牛血清（10％），苯基硫脲（10％），pH6．2～6．8。决定昆虫脂肪体细胞是否成系的关键因素包括：原代培养的组织能否同培养器皿表面紧密接触（贴壁），紧密贴壁的组织块倾向于游离出分裂能力较强的细胞群；在新生细胞长满瓶底时，处理好第一次或前几次转瓶、传代的步骤非常重要。最佳的初次传代方式是轻轻摇晃，将较易脱壁的细胞以较高的密度传入新的培养瓶中，同时注意不要扰动原组织块，减小对细胞的剪切力。原代培养换液量也需要根据细胞的生长状况而定，一般为换液量的50％。运用上述方法，本研究共建立了7株昆虫幼虫脂肪体细胞系（IOZCAS-Spex-Ⅱ，IOZCAS-Spex-Ⅲ，IOZCAS-Spex-Ⅳ，IOZCAS-Spex-Ⅴ，IOZCAS-Spex-Ⅵ，IOZCAS-Spex-Ⅶ，IOZCAS-Ha-Ⅰ），其中6株来自甜菜夜蛾（Spodoptera exigua），1株来自棉铃虫（Helicoverpa aimigera）。7株细胞系的细胞均以圆形为主；新建立的细胞系IOZCAS-Spex-Ⅱ和IOZCAS-Ha-Ⅰ的第10代细胞群体倍增时间分别为108．8h和65．2h；IOZCAS-Spex-Ⅱ和IOZCAS-Ha-Ⅰ染色体符合典型的鳞翅目染色体数目较多的特点，多数细胞为多倍体。使用DAF-PCR的方法，鉴定了新建立的细胞系分别来自其同源的昆虫，而与实验室保存的其它昆虫细胞系PCR扩增谱带不同。细胞长期冻存在-80℃的环境下，并保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且多次复苏成功。新建细胞系均对同源核型多角体病毒敏感，但敏感程度各不相同，对其它非同源种类的核型多角体病毒不敏感。对已建的细胞系IOZCAS-Spex-Ⅱ进行了单细胞克隆，当前正在进行放大培养。使用5’-BrdU掺入法标记了光肩星天牛脂肪体细胞在体内和体外的短期增殖情况，

论文目录

摘要

ABSTRACT

正文图表目录

第一章前言

1.1 引言

1.2 动物细胞培养技术概况

1.3 昆虫细胞系建立技术研究进展

1.3.1 昆虫细胞培养的特点

1.3.2 昆虫细胞系的建立和昆虫细胞培养液的发展

1.3.3 昆虫细胞系建立技术

1.3.4 昆虫细胞系的特征和鉴定

1.3.5 污染的避免

1.4 昆虫脂肪体细胞系建立研究进展

1.5 甜菜夜蛾细胞系建立研究进展

1.6 棉铃虫细胞系建立研究进展

1.7 昆虫细胞系的应用

1.7.1 大规模生产昆虫病毒杀虫剂

1.7.2 构建重组杆状病毒杀虫剂

1.7.3 构建杆状病毒表达载体系统

1.7.4 其他方面

1.8 细胞增殖检测方法研究进展

1.9 问题与展望——关于建立昆虫细胞系方法的讨论

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试昆虫种类及来源

2.1.2 供试病毒种类及来源

2.1.3 供比较的细胞系及来源

2.1.4 实验试剂

2.1.5 耗材

2.1.6 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 原代培养过程

2.2.2 传代培养方法

2.2.3 条件培养液的制备

2.2.4 细胞形状大小的观察和测量

2.2.5 细胞生长曲线

2.2.6 细胞核型分析

2.2.7 DAF-PCR鉴定细胞

2.2.8 细胞的冻存和复苏

2.2.9 原代病毒种子液的制备（SeNPV，HaNPV，SpltNPV）

2.2.10 多角体产量的测定

50)的测定'>2.2.11 50%组织培养感染剂量(TCID₅₀)的测定

2.2.12 SeNPV活性的生物测定

2.2.13 病毒离体传代

2.2.14 5'-BrdU掺入法标记检测细胞增殖

第三章结果与分析

3.1 昆虫脂肪体细胞体外增殖方法的建立

3.1.1 原代培养液的选择和确定

3.1.2 原代培养材料的选择

3.1.3 不同的处理对原代培养细胞体外增殖的影响

3.1.4 不同处理对传代细胞体外持续增殖的影响

3.2 昆虫脂肪体细胞体外增殖的检测及机理的初步探讨

3.2.1 昆虫体内脂肪体组织细胞增殖

3.2.2 昆虫脂肪体组织离体培养细胞增殖

3.2.3 传代处理对昆虫脂肪体组织增殖细胞的影响

3.3 几株昆虫脂肪体细胞系的建立、鉴定及特征

3.3.1 甜菜夜蛾幼虫脂肪体细胞系的建立、鉴定及对SeNPV的敏感性

3.3.2 棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的建立、鉴定及对HaNPV的敏感性

3.3.3 其它几种昆虫幼虫脂肪体细胞系建立的探索

第四章结论与讨论

4.1 结论

4.2 讨论

4.2.1 本研究中建立的6株甜菜夜蛾和1株棉铃虫幼虫脂肪体细胞系的意义

4.2.2 关于原代培养过程中组织贴壁这一关键步骤的讨论

4.2.3 从贴壁组织中游离出的细胞来源的讨论

4.2.4 不同种类昆虫脂肪体组织游离出细胞的可能性

4.2.5 原代培养不同组织材料的选择

4.2.6 关于传代过程中细胞持续增殖的讨论

4.2.7 传代细胞对病毒敏感与否的问题

4.2.8 染色体异倍化的问题

4.2.9 条件培养液的作用

4.2.10 细胞培养过程中需要注意的问题——关于经验的讨论

4.3 下一步的工作计划

参考文献

致谢

附录一试剂配制及仪器型号

附录二专有名词、缩写及昆虫学名

附录三导师简介

附录四作者在读期间发表的学术论文、申请专利情况及参加的科研项目

昆虫脂肪体细胞体外增殖方法及同源病毒敏感脂肪体细胞系建立研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢