本文主要研究内容
作者李媛（2019）在《腺病毒介导人卵泡刺激素基因在山羊乳腺上皮细胞的表达》一文中研究指出：卵泡刺激素(FSH)是动物体内最重要的性激素之一,主要作用于生殖细胞,在个体的发育、成熟以及生殖生理方面发挥着关键作用。市场上的FSH主要分为尿源FSH和细胞工程制备的FSH,前者的产量低、来源不均一,后者生产成本高、价格昂贵,不能满足市场需求。目前,动物乳腺制备蛋白药物具有产量高、价格低的特点,但利用大动物乳腺制备FSH的研究还未见报导,主要是因为动物体内的FSH过多会导致动物体的正常生理紊乱,最终导致动物死亡。由于FSH是通过FSHα与FSHβ亚基蛋白非共价键结合形成的异源二聚体糖蛋白,单独的FSHα和FSHβ亚基在动物体内都不具备生物学活性。因此本研究利用腺病毒将人FSHα与FSHβ亚基蛋白分别在山羊乳腺上皮细胞(GMEC)单独表达,然后将单独表达的FSHα和FSHβ亚基蛋白进行体外重组、纯化得到完整的重组人卵泡刺激素(rhFSH),并利用体外活性试验验证rhFSH具备生物活性。本研究针对山羊乳腺泌乳细胞在体外表达人FSH蛋白进行了探究,为将来利用大动物乳腺制备重组人卵泡刺激素提供技术依据。试验获得如下结果:1.以pIRES-FSH-neo3载体为模板,利用PCR技术,亚克隆得到了FSHα和FSHβ亚基基因。一步克隆法将目的基因分别连接在穿梭载体pAdTrack-CMV上构建了pAdTrack-CMV-FSHα和pAdTrack-CMV-FSHβ腺病毒穿梭载体。穿梭载体经鉴定后,用PmeI酶切使其线性化,与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得了pAdEasy-FSHα和pAdEasy-FSHβ重组腺病毒载体。2.将鉴定正确的重组腺病毒载体pAdEasy-FSHα和pAdEasy-FSHβ用PacI酶切线性化,用异丙醇沉淀法纯化之后,利用Lipofectamine 2000转染到HEK293A细胞中包装获得第一代重组腺病毒,经扩繁后得到高浓度的重组腺病毒。LaSRT法测得Ad-FSHα和Ad-FSHβ重组腺病毒浓度滴度均为1×10~9 pfu/mL。3.用重组腺病毒Ad-FSHα和Ad-FSHβ分别感染GMEC细胞,测得重组腺病毒Ad-FSHα的感染复数(MOI)为160,重组腺病毒Ad-FSHβ的MOI值为200。裂解细胞获取蛋白,经Western Blot检测表明,利用重组腺病毒可以在GMEC细胞中有效表达FSHα和FSHβ亚基蛋白。4.将GMEC细胞表达的FSHα与FSHβ亚基蛋白进行体外重组、纯化,利用双抗夹心ELISA法及Western Blot证明FSHα与FSHβ亚基蛋白成功在体外重组成完整的rhFSH。通过观察FSH靶向结合特异性受体(FSHR)及测定HKE-293-FSHR细胞cAMP值,表明体外重组的rhFSH和阳性对照药物Gonal-F同样具备生物活性。综上所述,本研究利用腺病毒介导人卵泡刺激素基因FSHα和FSHβ在山羊乳腺上皮细胞进行表达,产生的FSHα和FSHβ亚基蛋白,经体外重组、纯化得到rhFSH,且验证得出本研究制备的rhFSH具备生物学活性。这就为下一步利用大动物乳腺以及制备转基因动物生产重组人卵泡刺激素奠定了基础。
Abstract
luan pao ci ji su (FSH)shi dong wu ti nei zui chong yao de xing ji su zhi yi ,zhu yao zuo yong yu sheng shi xi bao ,zai ge ti de fa yo 、cheng shou yi ji sheng shi sheng li fang mian fa hui zhao guan jian zuo yong 。shi chang shang de FSHzhu yao fen wei niao yuan FSHhe xi bao gong cheng zhi bei de FSH,qian zhe de chan liang di 、lai yuan bu jun yi ,hou zhe sheng chan cheng ben gao 、jia ge ang gui ,bu neng man zu shi chang xu qiu 。mu qian ,dong wu ru xian zhi bei dan bai yao wu ju you chan liang gao 、jia ge di de te dian ,dan li yong da dong wu ru xian zhi bei FSHde yan jiu hai wei jian bao dao ,zhu yao shi yin wei dong wu ti nei de FSHguo duo hui dao zhi dong wu ti de zheng chang sheng li wen luan ,zui zhong dao zhi dong wu si wang 。you yu FSHshi tong guo FSHαyu FSHβya ji dan bai fei gong jia jian jie ge xing cheng de yi yuan er ju ti tang dan bai ,chan du de FSHαhe FSHβya ji zai dong wu ti nei dou bu ju bei sheng wu xue huo xing 。yin ci ben yan jiu li yong xian bing du jiang ren FSHαyu FSHβya ji dan bai fen bie zai shan yang ru xian shang pi xi bao (GMEC)chan du biao da ,ran hou jiang chan du biao da de FSHαhe FSHβya ji dan bai jin hang ti wai chong zu 、chun hua de dao wan zheng de chong zu ren luan pao ci ji su (rhFSH),bing li yong ti wai huo xing shi yan yan zheng rhFSHju bei sheng wu huo xing 。ben yan jiu zhen dui shan yang ru xian bi ru xi bao zai ti wai biao da ren FSHdan bai jin hang le tan jiu ,wei jiang lai li yong da dong wu ru xian zhi bei chong zu ren luan pao ci ji su di gong ji shu yi ju 。shi yan huo de ru xia jie guo :1.yi pIRES-FSH-neo3zai ti wei mo ban ,li yong PCRji shu ,ya ke long de dao le FSHαhe FSHβya ji ji yin 。yi bu ke long fa jiang mu de ji yin fen bie lian jie zai chuan suo zai ti pAdTrack-CMVshang gou jian le pAdTrack-CMV-FSHαhe pAdTrack-CMV-FSHβxian bing du chuan suo zai ti 。chuan suo zai ti jing jian ding hou ,yong PmeImei qie shi ji xian xing hua ,yu gu jia zai ti pAdEasy-1zai da chang gan jun BJ5183zhong tong yuan chong zu ,huo de le pAdEasy-FSHαhe pAdEasy-FSHβchong zu xian bing du zai ti 。2.jiang jian ding zheng que de chong zu xian bing du zai ti pAdEasy-FSHαhe pAdEasy-FSHβyong PacImei qie xian xing hua ,yong yi bing chun chen dian fa chun hua zhi hou ,li yong Lipofectamine 2000zhuai ran dao HEK293Axi bao zhong bao zhuang huo de di yi dai chong zu xian bing du ,jing kuo fan hou de dao gao nong du de chong zu xian bing du 。LaSRTfa ce de Ad-FSHαhe Ad-FSHβchong zu xian bing du nong du di du jun wei 1×10~9 pfu/mL。3.yong chong zu xian bing du Ad-FSHαhe Ad-FSHβfen bie gan ran GMECxi bao ,ce de chong zu xian bing du Ad-FSHαde gan ran fu shu (MOI)wei 160,chong zu xian bing du Ad-FSHβde MOIzhi wei 200。lie jie xi bao huo qu dan bai ,jing Western Blotjian ce biao ming ,li yong chong zu xian bing du ke yi zai GMECxi bao zhong you xiao biao da FSHαhe FSHβya ji dan bai 。4.jiang GMECxi bao biao da de FSHαyu FSHβya ji dan bai jin hang ti wai chong zu 、chun hua ,li yong shuang kang ga xin ELISAfa ji Western Blotzheng ming FSHαyu FSHβya ji dan bai cheng gong zai ti wai chong zu cheng wan zheng de rhFSH。tong guo guan cha FSHba xiang jie ge te yi xing shou ti (FSHR)ji ce ding HKE-293-FSHRxi bao cAMPzhi ,biao ming ti wai chong zu de rhFSHhe yang xing dui zhao yao wu Gonal-Ftong yang ju bei sheng wu huo xing 。zeng shang suo shu ,ben yan jiu li yong xian bing du jie dao ren luan pao ci ji su ji yin FSHαhe FSHβzai shan yang ru xian shang pi xi bao jin hang biao da ,chan sheng de FSHαhe FSHβya ji dan bai ,jing ti wai chong zu 、chun hua de dao rhFSH,ju yan zheng de chu ben yan jiu zhi bei de rhFSHju bei sheng wu xue huo xing 。zhe jiu wei xia yi bu li yong da dong wu ru xian yi ji zhi bei zhuai ji yin dong wu sheng chan chong zu ren luan pao ci ji su dian ding le ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北农林科技大学的李媛，发表于刊物西北农林科技大学2019-07-11论文，是一篇关于腺病毒论文,山羊乳腺上皮细胞论文,体外重组论文,生物活性论文,西北农林科技大学2019-07-11论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北农林科技大学2019-07-11论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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