烟草属（Nicotiana）抗病基因VIGS沉默系统的构建

论文摘要

植物中已经克隆出来的抗病基因大多数包含NBS-LRR结构域,这类基因经常以簇的形式存在于基因组中,其中有功能的抗病基因会与其相应病原体的无毒基因作用,发生程序性细胞死亡（即过敏反应）,从而限制病原物的扩散来保护植株的其它部位不受侵染。本实验以烟草野生种为对象,研究接种苗龄、农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度和培养温度等四个方面对11种烟草野生种VIGS（virus induced gene silencing, VIGS）沉默效率的影响,优化最合适的VIGS沉默体系：研究表明,在烟草苗龄6叶（出苗后生长20～25天）,侵染的农杆菌OD600值0.6,AS浓度为400mmol/L,培养环境为22℃,16h黑暗；18℃,8h光照条件下,可以获得VIGS沉默的最佳效果。此外,本研究在该条件下对另外14种烟草野生物种VIGS沉默效率也进行了研究。同时根据茄科中已知的抗病基因的序列设计引物,在Nicotiana alata中扩增,进而构建pTRV系统病毒诱导的基因沉默（VIGS）载体。本研究共构建了113个载体,覆盖了茄科中所有已知的抗病基因家族。利用已知功能的人7基因,对该系统进行验证,结果表明其中的N基因家族沉默载体有效地沉默了N. benthamiana中的对烟草花叶病毒（TMV）抗性。该套VIGS载体有望用于分析烟草属中NBS-LRR编码的各种抗性,并快速克隆抗病基因,从而为烟草、番茄、马铃薯等作物提供新的抗性资源。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 植物病害
• 1.2 植物免疫系统
• 1.2.1 植物抗病基因
• 1.2.2 TMV与N基因的互作
• 1.3 抗病基因的克隆方法
• 1.3.1 转座子标签技术
• 1.3.2 图位克隆
• 1.3.3 抗病基因同源序列克隆
• 1.3.4 比较基因组学
• 1.4 病毒诱导的基因沉默（VIGS）
• 1.4.1 VIGS的原理
• 1.4.2 VIGS操作中需要注意的问题
• 1.4.3 VIGS的优点
• 1.4.4 VIGS的缺点以及改善措施
• 1.5 课题研究目的
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 烟草野生种
• 2.1.2 材料的种植
• 2.1.3 生物信息学分析数据库
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 构建VIGS载体
• 2.2.2 烟草中VIGS沉默效率因素研究
• 2.2.3 不同烟草野生种中VIGS沉默效果
• 2.2.4 VIGS沉默载体有效性检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 结果
• 3.1.1 目标基因引物设计
• 3.1.2 载体构建结果
• 3.1.3 以N基因检测已构建VIGS载体有效性
• 3.1.4 分析不同条件下烟草不同野生物种的VIGS效率
• 3.1.5 最佳条件下烟草属的一些物种VIGS沉默效果分析
• 3.2 讨论
• 3.2.1 VIGS体系优化存在的问题
• 3.2.2 如何应用VIGS体系
• 附录
• 参考文献
• 致谢