氧化三甲胺代谢相关菌的研究

论文摘要

本文用含有氧化三甲胺（Trimethylamine-N-oxide,TMAO）的液体培养基经过富集分别从鳕鱼的体表和内脏获得能够参与TMAO代谢的混合菌群,并通过对混合菌群144h的培养,对使用非抑制性离子色谱法对其代谢TMAO能力进行了检测。结果显示来自内脏和表皮的混合菌群都能够利用TMAO,产生大量的NH4+和三甲胺（ Trimethylamine ,TMA）,但是在内脏和体表混合菌群中TMAO被利用的情况却并不同。在内脏混合菌的发酵后期TMAO、NH4+和TMA都处于动态平衡,而在体表混合菌的发酵过程中TMAO含量一直下降并完全被利用完毕,TMA含量先上升后下降,NH4+则一直处于上升状态。这说明在内脏和体表的混合菌中有着不同的菌种构成,在体表的混合菌中存在着能够利用TMAO还原产物TMA的细菌,而在内脏混合菌种不存在能够继续代谢TMA的微生物。对来源于内脏和表皮混合菌群进行分离纯化,共得到14株菌,通过对它们代谢TMAO的能力进行检测,分析了它们在参与TMAO代谢过程中可能的途径。对分离的到的14株菌株中能够代谢TMAO的5株细菌进行了16SrDNA的分析鉴定,对于经过反复培养分别得到两株能够稳定代谢TMAO的菌株,NZ-2和BP-1-1,再经过Biolog微孔鉴定,最终确定这两株菌分别是Stenotrophomonas maltophilia（嗜麦芽糖寡氧单胞菌）和Providencia rettgeri（雷士普罗威登斯菌）,在目前国内外能够代谢TMAO的细菌的文献中尚未出现,说明它们可能是新种。通过对能够代谢TMAO的两株细菌BP-1-1和NZ-2对TMAO的利用情况进行研究,发现BP-1-1和NZ-2均不能利用TMAO作为唯一碳源和氮源,这与目前的报道相一致。TMAO可能是这两株菌呼吸产能过程中的电子传递的最终受体,并将其还原为TMA,对TMAO的还原产物TMA不能继续代谢产生甲醛或者其他含氮物质。通过在有氧和厌氧条件下对BP-1-1和NZ-2进行培养,并对其发酵液中TMAO及其代谢产物的检测,发现BP-1-1和NZ-2在生长过程中对TMAO的还原并不受氧气的抑制,而有氧条件下比在厌氧条件下对TMAO还原程度更大,这说明在这两株细菌中所存在的TMAO还原酶与先前报道的大肠杆菌等细菌中的TMAO还原酶可能不同,在有氧存在时具有更高的活性,并且可能存在着与大肠杆菌以细胞色素为中间介质的电子传递过程不同的电子转移方式。本文通过分析24h内BP-1-1和NZ-2在有氧和厌氧条件下对TMAO的利用情况和细菌的生长情况,确定TMAO还原所发生的阶段是在BP-1-1和NZ-2的生长对数期,这与目前报道是一致的。此外,通过在新鲜鳕鱼肉中分别加入适当浓度的BP-1-1和NZ-2菌悬液,置于冷藏温度和室温下恒温恒湿培养,并用加入对应体积的无菌生理盐水的新鲜鳕鱼肉作空白对照,通过感官观察发现,在室温条件下加入BP-1-1和NZ-2菌悬液的鳕鱼肉细菌大量繁殖,并且迅速导致鱼肉的腐败。将鱼肉中TMAO及其代谢产物的检测结果与空白对照进行对比,发现鱼肉在细菌侵染的情况下,其中的TMAO迅速被还原为TMA,而且鱼肉中的TMAOase也被快速的激活,在18h时就有DMA的产生,并随着腐败过程而逐渐积累。这说明鳕鱼肉能为BP-1-1和NZ-2提供非常好的生长环境,BP-1-1和NZ-2菌悬液加入后,细菌快速生长繁殖导致鱼肉组织的迅速软化和水解,加速了鱼肉的腐败,而这一过程又促进了组织中的TMAOase释放与激活,使鱼肉组织中的DMA和FA含量迅速增加。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 0.1 我国水产品安全现状
• 0.2 氧化三甲胺
• 0.2.1 氧化三甲胺的性质
• 0.2.2 氧化三甲胺的来源和分布
• 0.2.3 TMAO 的生理功能
• 0.2.4 TMAO 的降解途径
• 0.3 三甲胺、二甲胺和甲醛
• 0.3.1 三甲胺
• 0.3.2 二甲胺
• 0.3.3 甲醛
• 0.4 氧化三甲胺酶的研究
• 0.4.1 TMAOase 的种类和来源
• 0.4.2 TMAOase 的分布
• 0.4.3 TMAOase 酶学特性的研究
• 0.5 氧化三甲胺还原酶的研究
• 0.5.1 氧化三甲胺还原酶的来源和分布
• 0.5.2 氧化三甲胺还原酶的性质
• 0.6 本课题研究内容、目的及意义
• 参考文献
• 1 检测方法的确定
• 引言
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 雷士盐法测定TMAO 的标准曲线
• 1.2.2 铜铵法测定二甲胺标准曲线
• 1.2.3 非抑制型离子色谱法测定TMAO、TMA、DMA
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 雷士盐法测定TMAO 的标准曲线
• 1.3.2 铜铵法测定DMA 标准曲线
• 1.3.3 离子色谱法测定TAMO、TMA、DMA
• 1.4 本章小结
• 2 菌种的分离纯化
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 体表和内脏混合菌群的获取
• 2.2.3 菌种的分离纯化
• 2.2.4 纯化后的细菌代谢TMAO 的能力检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 内脏混合菌群代谢TMAO 能力检测
• 2.3.2 体表混合菌群代谢TMAO 能力检测
• 2.3.3 体表和内脏分离纯化所得菌种代谢TMAO 能力检测
• 2.4 本章小结
• 3 菌种鉴定
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验菌种
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 稳定代谢TMAO 菌种的获得
• 3.2.2 菌株生理生化特征实验
• 3.2.3 16S rRNA 基因的克隆与序列测定
• 3.2.4 Biolog 生物鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 菌株的生理生化特征
• 3.3.2 16S rRNA 基因序列分析和系统发育树构建
• 3.3.4 Biolog 生物鉴定
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 4 TMAO 在细菌代谢过程中的作用
• 引言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 TMAO 含量对细菌生长的影响
• 4.2.2 TMAO 作为唯一碳源实验
• 4.2.3 TMAO 作为唯一氮源实验
• 4.2.4 氧气对细菌代谢TMAO 的影响
• 4.2.5 TMAO 代谢和细菌生长曲线的关系
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 TMAO 含量对细菌生长的影响
• 4.3.2 TMAO 作为唯一碳源实验结果
• 4.3.3 TMAO 作为唯一氮源实验结果
• 4.3.4 氧气对细菌代谢TMAO 的影响
• 4.3.5 生长曲线
• 4.4 本章小结
• 5 鱼肉腐败实验
• 引言
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验菌种
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 鱼肉块的制备
• 5.2.2 鱼肉腐败试验
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 感官观察
• 5.3.2 加入菌悬液鱼肉中细菌的种类和含量
• 5.3.3 对照组鱼肉中细菌的种类和含量
• 5.3.4 鱼肉中TMAO 及其代谢产物的检测
• 5.4 本章小结
• 6 结语
• 7 创新点
• 8 展望
• 致谢
• 个人简历
• 学术成果