论文摘要
随着原子能在国防、工业、农业、医疗、科技等国民经济各领域的普及应用,核能在巨大造福人类的同时,也给当今世界带来严重的核辐射危险,给人类的健康与安全带来了严峻的挑战。核武器的出现和使用给现代战争带来了更大的威胁,拥有核武器国家的增加及核武器的加速扩散增加了爆发局部战争的危险。我国也是核大国,拥有核武器、核潜艇等战略核力量,还有大量的核电站,因而核辐射防护在保障从业人员身体健康中具有重要的特殊地位,它在未来核战争、平时反核恐怖袭击,以及核电站事故应急救援中也具有重要的战略意义,加强核辐射损伤防护研究任重道远。现代生物医学的不断发展,放射治疗已经成为恶性肿瘤以及一些良性疾病的重要治疗手段,可是辐射对正常组织的损伤,限制了放疗的发展。降低辐射所造成正常组织细胞的损伤,给放射防护学家提出了新课题。探索高效、低毒的辐射防护剂始终是国内外放射防护研究的重点和难点。电离辐射对生物体构成的损伤,主要来自直接作用和间接作用,其中间接作用引起的损伤占辐射损伤的70%-80%左右,因此辐射防护剂的研究重点在于缓解或者清除辐射所产生的大量自由基,提高机体的抗放能力,从而保护机体组织和器官免受伤害。2007年,Ohsawa等人发现氢气可以选择性减少细胞毒性氧自由基,发挥治疗性抗氧化作用。从此,在世界范围内掀起了研究氢气的热潮,也正是氢气能够选择性减少羟自由基引起了我们辐射防护研究者的兴趣,因为在辐射损伤中大部分损伤是有羟自由基所导致。因此,我们推测其具有很好的辐射防护效果。H2以前又被误认为生理性惰性气体,因为研究者认为其不会与体内的任何物质发生反应,而且人的肠道细菌不断的产生氢气并在血液中循环。因此,低浓度的氢气对人体是无毒副作用的。从而,它具有很好的应用前景。氢气是易燃气体,具有一定的危险性,将其溶于各种溶剂中再予以使用则解决了这个问题,并可使用于临床。而目前在国际上并无报道将氢气用于辐射防护,电离辐射可以造成机体多种系统器官损伤,尤其对由增殖更新迅速的细胞构成的组织造成的损伤更为严重,如造血系统就是机体高辐射敏感组织之一。电离辐射不仅可以对造血干细胞、造血祖细胞引起抑制和破坏,也能引起骨髓血窦的损伤。在这一领域国际上存在着很大的空白,对于此方面的研究将填补这项空白,具有很大的研究价值。研究内容:1.富H2溶液的制备:采用特种装置将氢气通入生理盐水、PBS、或培养基等溶液,再通过加压仓对其高压（0.4MPa）加压6个小时。摸索出较好的合成方案和技术方法。2.富H2溶液对细胞的辐射防护效应:选取淋巴母细胞（AHH-1细胞）作为研究细胞,做出细胞在不同照射剂量下的剂量存活曲线,分别观察:①不同浓度的富H2溶液对相同γ射线照射剂量照射后细胞的防护作用。②相同浓度的富H2溶液对不同照射剂量细胞的防护作用。③相同浓度的富H2溶液不同时间给药对AHH-1细胞存活率的影响。④富H2溶液对照后细胞乳酸脱氢酶露出率影响（LDH）。3.富H2溶液对小鼠造血系统的辐射防护效应:①富H2溶液对γ射线照后外周血白细胞（WBC）的影响②富H2溶液对γ射线照后骨髓有核细胞计数的影响③定量分析富H2溶液对γ射线照后小鼠内源性脾结节计数的影响④分析富H2溶液对γ射线照后小鼠CFU-GM的影响④富H2溶液对照后血液抗氧化酶SOD、GSH的影响。⑤富H2溶液对照后血液脂质氧化产物MDA的影响。4.初步探讨富H2溶液的辐射防护效应机制:分析该富H2溶液对照后细胞DNA影响,8-OHdG浓度影响等。实验方法:1.富H2溶液的制备:参考国内外有关文献,用本实验室已摸索出的平台,优化制备方法,制备富H2溶液。2.细胞培养:AHH-1细胞为来源于人淋巴母细胞系的建株细胞（本实验室长期培养）。细胞培养条件:RMPI-1640培养基（Hyclone公司）,10%NCS（GIBCO公司）,37℃,5%CO2,饱和湿气,在细胞培养箱中孵育。3.细胞γ射线照射:用钴-60γ射线照射不同剂量。4.细胞存活率测定:用CCK-8检测不同处理细胞的存活率。细胞存活率（%）=（药物组OD值-本底/对照组OD值-本底）×100%5.细胞凋亡分析:用荧光染色法及Annexin V/PI双染,流式细胞仪检测凋亡百分率的变化。6.外周血白细胞、骨髓有核细胞计数:采用细胞计数器计数。7.LDH、SOD、GSH、MDA检测:采用试剂盒进行检测。8.细胞8-OHdG浓度分析:通过8-OHdG Elisa试剂盒,检测不同浓度富H2溶液对照后细胞的8-OhdG浓度影响。9.细胞DNA检测:通过单细胞凝胶电泳分析,荧光显微镜下观察其拖尾情况,拖尾越长,DNA损伤越严重。10.统计方法:单组间比较采用t检验;多组间比较采用方差分析,数值以x ?sd表示, P<0.05为有差异统计学意义。实验结果:1.富H2溶液的制备和浓度分析:采用特种装置,先将生理盐水或PBS、蒸馏水等溶剂内加注纯氢气,再在高压（0.4MPa）下放置4小时以上,以便使氢气充分溶解,使其达到饱和状态。利用液体氢气浓度测定电极（Biogas Analyzer Systems-1000, Mitleben, Japan）进行浓度测定。检测发现制备的富H2溶液中氢气浓度达到过饱和浓度（富H2纯净水:0.823mmol/L富H2生理盐水:0.809mmol/L;富H2 PBS:0.814 mmol/L）2.富H2溶液对AHH-1细胞的辐射生物学效应2.1不同浓度富H2溶液对相同剂量照后AHH-1细胞存活率的影响:分别用CCK-8检测4Gy照射后48h,AHH-1细胞的存活率的变化。发现在0-0.4mmol/L范围内,随着氢气浓度的增加细胞存活率上升,当氢气浓度为0.4mmol/L,CCK-8检测细胞存活率分别为84.0%,相对于单纯照射组（63.2%）,有显著的差异（P<0.05）。2.2相同浓度富H2溶液不同照射剂量对AHH-1细胞存活率的影响:给药浓度为0.4mmol/L时,用CCK-8检测了不同照射剂量照射后48h AHH-1细胞的存活率,1、2、4、8Gy照后24h给药组与各单纯照射组AHH-1细胞均有不同程度下降,但各给药组细胞存活率均高于单纯照射组,照射剂量为8Gy时,给药组与单纯照射组细胞存活率分别为74.4%和48.3%。（P<0.01）。2.3相同浓度富H2溶液不同时间给药对AHH-1细胞存活率的影响:单纯照射6Gy后48h CCK-8检测AHH-1细胞存活率为40.1%,照前给予0.4mmol/L富H2溶液,给药组细胞存活率提高至89.8%,与单纯照射组细胞存活率相比有统计学意义（P<0.01）。照后给药虽略有上升（42.3%）,但单纯照射组细胞存活率相比没有统计学意义（P>0.05）。2.4富H2溶液对照后AHH-1细胞早期凋亡的影响: 4Gy照射组AHH-1细胞Annexin V/PI双染检测的早期凋亡率为21.5%,给药组早期凋亡率下降为10.19%,与单纯照射组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。荧光染色法检测细胞凋亡,给药组细胞凋亡率为26.1%,明显低于单纯照射组的49.3%,具有统计学意义,（P<0.01）。2.5富H2溶液对不同照射剂量照射后AHH-1细胞LDH漏出率影响:给药浓度为0.3mmol/L时,用LDH试剂盒检测了不同照射剂量照射后4h AHH-1细胞的LDH漏出率,1、2、4、8Gy照后4h给药组与各单纯照射组AHH-1细胞悬液中LDH活性均有不同程度升高,但各给药组细胞悬液中LDH活性均低于单纯照射组,具有统计学意义（P<0.05）。3.富H2溶液对小鼠造血系统的辐射防护效应:3.1富H2溶液对γ射线照后小鼠外周血WBC的影响: 2、4Gy照后30天内给药组与单纯照射组小鼠外周血白细胞数均有不同程度的降低,但腹腔注射0.6mmol/L富H2溶液的给药组小鼠外周血白细胞数均高于单纯照射组。（P<0.05）3.2富H2溶液对γ射线照后小鼠骨髓有核细胞计数的影响: 4Gy照后30天内给药组与单纯照射组小鼠骨髓有核细胞计数均有不同程度的降低,但腹腔注射0.6mmol/L富H2溶液的给药组骨髓有核细胞计数显著高于单纯照射组。（P<0.05）3.3富H2溶液对γ射线照后小鼠内源性脾结节计数的影响: 7Gy照后第11天给药组与单纯照射组小鼠脾结节数量均有不同程度的升高,但腹腔注射0.6mmol/L富H2溶液的给药组骨髓有核细胞计数显著高于单纯照射组。（P<0.05）3.4富H2溶液对γ射线照后小鼠粒-单细胞集落（colony formation unit of granulocyte/macrophage progenitors,CFU-GM）的影响: 7Gy照后将骨髓有核细胞分离计数培养,第7天给药组与单纯照射组细胞克隆集落数量均有不同程度的降低,但腹腔注射0.6mmol/L富H2溶液的给药组克隆集落数显著高于单纯照射组。（P<0.05）3.5富H2溶液对γ射线照后小鼠生存率的影响:照射前给予小鼠喂养富H2纯净水,7Gyγ射线照后观察小鼠30天生存率,给药组小鼠生存率显著高于单纯照射组小鼠生存率。（P<0.05）4.富H2溶液细胞辐射生物学效应的机理探讨4.1富H2溶液对受照AHH-1细胞8-OHdG的影响:通过8-OHdG试剂盒检测单纯照射组和各给药组照后8-OHdG浓度,反映照后细胞受损程度。结果发现,给药组AHH-1细胞照后8-OHdG浓度较单纯照射组有明显降低（P<0.05）。4.2富H2溶液对照后AHH-1细胞DNA的影响:通过中性单细胞凝胶电泳实验检测照后AHH-1细胞DNA双链断裂损伤情况,并利用CAPS-1软件分析。结果发现,正常细胞组在中性电泳中基本无拖尾显现,单纯照射组与照射加药组均有一定程度的拖尾,给药组细胞拖尾显著减少。（P<0.01）4.3富H2溶液对照后血液抗氧化酶超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）的影响: 4、8Gy照后12h给药组与单纯照射组小鼠外周血SOD活性和GSH浓度均有不同程度的下降,但腹腔注射0.6mmol/L富H2溶液的给药组小鼠外周血SOD、GSH活性显著高于单纯照射组。4.4富H2溶液对照后脂质氧化产物丙二醛（malondialdehyde,MDA）的影响:腹腔注射0.6mmol/L富H2溶液后, 4、8Gy照后12h给药组与单纯照射组小鼠外周血MDA浓度均有不同程度的升高,但给药组小鼠外周血MDA浓度显著低于单纯照射组。讨论与初步结论辐射对机体的损伤主要分为直接损伤和间接损伤,而辐射防护的重点主要是针对间接损伤,即通过清除辐射产生的自由基,减轻对机体的损伤。近年发现,H2具有选择性清除羟自由基的能力,但由于氢气易燃、易爆,这极大的影响了其生物学效应的发挥。目前解决其易燃、易爆主要手段是通过在将氢气在高压下溶解于溶液（生理盐水、PBS、水等）,制成过饱和溶液。细胞生物学实验发现富H2PBS能提高照后AHH-1细胞的存活率,并能降低AHH-1细胞的早期凋亡。而且照前给药对提高AHH-1细胞的存活率效果优于照后给药。我们还发现富H2溶液对小鼠造血系统也具有很强的辐射防护效应,照前给药能够提高其外周血白细胞及骨髓有核细胞数量,同时能够促进小鼠CFU-S及CFU-GM的形成,我们进一步对富H2溶液的辐射防护机制进行了初步研究,发现照前给药能有效减少照后AHH-1细胞8-OHdG的含量并减少对DNA的损伤,并能保护小鼠体内抗氧化酶（SOD、GSH）水平,降低脂质氧化产物MDA的形成。结论:富H2溶液对AHH-1细胞和小鼠造血系统辐射损伤具有较好的防护作用,其机理与清除辐射自由基和减轻由此引起的生物分子氧化损伤有关。由于H2已被证明对人体无毒无害,因此富H2溶液在辐射损伤防护领域将有很好的应用前景。