鲫鱼IgM单克隆抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体ELISA检测方法的建立

论文摘要

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）分布于世界各地,广泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中,对水产养殖及野生鱼、虾、蛙、甲鱼等生物有致病性,并可进一步通过水产动物和水产品感染人畜,造成人畜腹泻和败血症等。它们所致的鱼类等嗜水气单胞菌病具有流行广、发病快、死亡率高等特点,常常造成养殖渔业的巨大经济损失。因此,建立快速、特异、有效的检测和鉴定嗜水气单胞菌的方法显得尤为重要。研究证实,鱼类在受到微生物、寄生虫等病原体感染或接受人工免疫后,均能产生由免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）介导的特异性体液免疫反应。这些免疫球蛋白在鱼体的免疫防御中起着十分重要的作用。因此,制备高纯度的鱼类免疫球蛋白对于研究鱼类体液免疫应答规律、建立以免疫球蛋白为核心的病原快速诊断和鱼类血清学分析方法具有重要的意义。采用饱和硫酸铵分步盐析结合Macro-prep high Q Cartridge阴离子交换柱以及SephacrylTM S-300凝胶柱层析提取纯化了非免疫鲫鱼血清IgM,免疫BALB/c鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了6株分泌抗鲫鱼血清IgM单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞株,分别命名为A1、C2、C3、F3a、F3b和F3c，Ig亚类分别是IgG1、IgG1、IgG2a、IgG1、IgG1和IgM。用间接ELISA检测,C3和F3a的细胞培养上清液的效价均为1×103,腹水效价为1×108～1×1011；A1、C2、F3b和F3c的细胞培养上清液的效价为1×101～1×102,腹水效价为1×103～4×106。用间接ELISA分析特异性,6株mAbs均为抗鲫鱼血清IgM特异性单克隆抗体。Western blotting表明,6株mAbs在蛋白分子量约79.2kDa处有特异性条带。运用HisTrap Protein G HP亲和层析柱纯化腹水并进行了HRP标记；同时将纯化好的腹水与CNBr活化的琼脂糖凝胶偶联,制备亲和层析柱,纯化鲫鱼血清IgM,SDS.PAGE检测表明,提纯的鲫鱼血清IgM纯度较高,其分子量为837kDa左右,重链分子量为79.2kDa左右,轻链分子量为25.5kDa左右。为了监测免疫动物的抗体水平以及流行病学调查的需要,本试验以灭活Ah J-1为包被抗原,抗鲫鱼血清IgM单克隆抗体作为酶标二抗,建立检测鲫鱼IgM抗体水平的间接ELISA方法。经筛选确定,抗原最适工作浓度为107cfu/mL;血清最佳稀释度为1：160；抗原抗体最佳作用条件为37℃1.5h；酶标二抗最佳工作浓度和反应时间分别为1：200,37℃1.5h；底物的最佳反应时间为15min；血清样品OD450值≥0.208,且P/N≥2.1判为阳性,OD450值≤0.178为阴性；建立的间接ELISA检出下限为1：1280,高于玻片凝集试验的1：320；重复性试验和稳定性试验表明：血清的批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明建立的间接ELISA方法具有良好的可重复性和稳定性。运用已建立的间接ELISA方法测定了鲫鱼不同免疫及感染时期血清中IgM抗体水平的动态变化,结果显示：免疫组首免7d未在鲫鱼血清中检测到IgM抗体,8-10d开始出现IgM抗体并呈上升趋势；30-40d血清中IgM抗体水平达到高峰；感染组感染后3d未在鲫鱼血清中检测到IgM抗体,8-10d开始出现IgM抗体并呈上升趋势；20-30d血清中IgM抗体水平达到高峰。以灭活Ah J-1作为检测抗原,兔抗Ah J-1作为竞争抗体,利用竞争原理针对淡水鱼感染嗜水气单胞菌建立了一种快速的间接竞争ELISA检测方法,并对工作条件进行了优化。结果表明：抗原最适工作浓度为107cfu/mL;兔抗血清最佳稀释度为1：5000；酶标二抗最佳工作浓度和反应时间分别为1：5000,37℃1.0h；检测血清的最佳稀释度为1：2；最佳竞争反应时间为1.0h；底物的最佳反应时间为10min。该方法对60份健康鲫鱼血清样品进行检测,并用统计学方法对检测数据进行了分析,确定了阳性值判定标准为：在阴性对照PI<30%情况下,抑制率大于36%为阳性。对实验室感染的60份鲫鱼血清分别用间接竞争ELISA.间接ELISA和凝集试验进行病原体检测,结果表明,建立的间接竞争ELISA检出率为56.7%,比传统的凝集试验（30%）要敏感,虽然没有间接ELISA（66.67%）敏感,但是它能用一种兔的抗体检测不同的血清样品,而不需要针对不同鱼种的二抗,为病原的检测提供方便。同时对临床的93份血清进行检测,阳性率为35.48%,与凝集试验的符合率为89.24%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 鱼类嗜水气单胞菌检测方法研究进展
• 1 嗜水气单胞菌的概况
• 1.1 嗜水气单胞菌的理化特征
• 1.2 嗜水气单胞菌的抗原结构与免疫学特征
• 2 嗜水气单胞菌的检测方法
• 2.1 常规生化鉴定方法
• 2.1.1 生化鉴定
• 2.1.2 选择培养基鉴定
• 2.2 免疫学方法
• 2.2.1 酶联免疫技术
• 2.2.2 免疫荧光技术
• 2.2.3 SPA协同凝集试验
• 2.2.4 其他免疫学技术
• 2.3 分子生物学方法
• 2.3.1 单克隆抗体（McAb）技术
• 2.3.2 聚合酶链式反应
• 2.3.3 脉冲场凝胶电泳（PFGE）
• 2.3.4 RAPD技术
• 2.3.5 LAMP技术
• 2.3.6 基因芯片
• 2.3.7 核酸探针技术
• 3 展望
• 参考文献
• 第二章 鱼类免疫球蛋白研究进展
• 1 鱼类的免疫球蛋白
• 1.1 血清中Ig
• 1.1.1 软骨鱼类
• 1.1.2 硬骨鱼类
• 1.2 鱼类其他部位的Ig
• 2 鱼类IG产生的组织和细胞
• 3 鱼类IG产生的基本过程和一般规律
• 4 鱼类免疫球蛋白分子及其基因结构
• 4.1 鱼类免疫球蛋白分子结构
• 4.2 鱼类免疫球蛋白的基因结构
• 5 鱼类免疫球蛋白的生物学功能
• 5.1 分泌型Ig的功能
• 5.2 膜型Ig的功能
• 6 影响IG产生的因素
• 6.1 抗原方面
• 6.2 鱼体方面
• 6.3 环境因素
• 6.3.1 温度
• 6.3.2 营养
• 6.3.3 其他
• 6.4 免疫方法的影响
• 7 鱼类免疫球蛋白的检测方法
• 8 鱼类免疫球蛋白的研究意义
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第一章 鲫鱼血清IgM的纯化及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞、试验动物及试剂
• 1.1.2 试剂配制
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 抗原制备
• 1.2.1 鲫鱼血清的制备
• 1.2.2 饱和硫酸铵分级沉淀
• 1.2.3 Macro-prep high Q离子交换层析
• 1.2.4 Sephacryl S-300凝胶过滤层析
• 1.2.5 样品浓缩及保存
• 1.2.6 纯度分析及分子量测定
• 1.3 杂交瘤细胞株的建立
• 1.3.1 免疫动物
• 1.3.2 饲养细胞的制备
• 1.3.3 SP2/0骨髓瘤细胞的培养
• 1.3.4 细胞融合
• 1.3.5 筛选
• 1.3.6 杂交瘤细胞的克隆化
• 1.3.7 杂交瘤细胞的冻存和复苏
• 1.3.8 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性
• 1.4 单克隆抗体的大量制备及鉴定
• 1.4.1 诱生腹水
• 1.4.2 抗体效价测定
• 1.4.3 类测定
• 1.5 腹水的纯化及标记
• 1.5.1 装柱及平衡
• 1.5.2 加样及洗脱
• 1.5.3 样品浓缩及保存
• 1.5.4 鼠抗鲫鱼IgG酶标抗体的制备
• 1.6 CNBr-activated Sepharose 4B结合单克隆抗体纯化IgM
• 1.6.1 亲和层析柱的制备
• 1.6.2 亲和层析
• 2 结果
• 2.1 鲫鱼血清IgM纯化
• 2.2 SDS-PGAE检测
• 2.3 杂交瘤细胞系的建立
• 2.4 单克隆抗体的鉴定
• 2.4.1 类与抗体效价
• 2.4.2 抗体特异性
• 2.5 腹水的纯化及检测
• 2.6 鲫鱼血清免疫球蛋白IgM单克隆抗体的标记
• 2.7 亲和层析纯化鲫鱼IgM结果及鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 嗜水气单胞菌IgM抗体间接ELISA检测方法的建立
• 1 材料
• 1.1 试验鱼与菌株
• 1.2 主要试剂及实验仪器
• 2 方法
• 2.1 包被抗原的制备
• 2.2 血清的制备
• 2.2.1 阳性血清的制备
• 2.2.2 阴性血清的制备
• 2.2.3 不同免疫时期鲫鱼免疫血清的制备
• 2.2.4 不同感染时期鲫鱼免疫血清的制备
• 2.3 间接ELISA方法的建立
• 2.3.1 间接ELISA方法的操作程序
• 2.3.2 间接ELISA方法条件的优化
• 2.4 敏感性试验
• 2.5 重复性与稳定性试验
• 2.6 不同免疫及感染时期鲫鱼IgM抗体水平的检测
• 3 结果
• 3.1 间接ELISA最佳反应条件
• 3.1.1 抗原包被浓度和血清稀释度
• 3.1.2 包被条件
• 3.1.3 封闭液
• 3.1.4 抗原抗体最佳作用时间
• 3.1.5 酶标二抗最佳稀释度和作用时间
• 3.1.6 底物作用时间
• 3.2 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定
• 3.3 间接ELISA敏感性试验
• 3.4 间接ELISA的重复性与稳定性试验
• 3.5 不同免疫时期鲫鱼血清IgM抗体水平的检测
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 嗜水气单胞菌抗体间接竞争ELISA检测方法的建立
• 1 材料
• 1.1 主要试剂及实验仪器
• 1.2 试验动物
• 1.3 试验菌株
• 2 方法
• 2.1 包被抗原的制备
• 2.2 血清的制备
• 2.2.1 Ah J-1兔抗血清的制备
• 2.2.2 兔抗血清效价的测定
• 2.2.3 阳性血清的制备
• 2.2.4 阴性血清的制备
• 2.2.5 感染血清的制备
• 2.3 检测嗜水气单胞菌抗体的间接竞争ELISA方法
• 2.3.1 间接竞争ELISA检测嗜水气单胞菌操作程序
• 2.3.2 间接竞争ELISA方法条件的优化
• 2.4 敏感性试验
• 2.5 重复性与稳定性试验
• 2.6 临床检测
• 3 结果
• 3.1 兔抗血清效价检测
• 3.2 间接竞争ELISA 工作条件
• 3.2.1 抗原包被浓度和抗血清最佳稀释度
• 3.2.2 封闭条件
• 3.2.3 酶标二抗最佳稀释度和工作时间
• 3.2.4 底物作用时间
• 3.2.5 待检血清最佳稀释度的确定
• 3.2.6 最佳竞争反应时间
• 3.2.7 临界值的确定
• 3.3 敏感性试验
• 3.4 重复性与稳定性试验
• 3.4.1 批内重复性
• 3.4.2 批间重复性
• 3.5 符合性试验
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢