靶向MDR1基因的小分子干扰RNA治疗卵巢癌的动物体内研究

论文摘要

目的本实验使用脂质体转染靶向MDR1基因的小分子干扰RNA作用于卵巢癌腹水瘤模型中P-gp的过度表达,进一步证实靶向MDR1基因的小分子干扰RNA体内抑制MDR1与P糖蛋白表达的效果以及对肿瘤生长的影响。方法1.使用荧光标记的siRNA检测siRNA的转染效率,优化转染条件。2.设计靶向MDR1基因的三条siRNA/MDR1,并用脂质体分别转染到卵巢癌SKOV3/AR细胞中,转染48小时后使用RT-PCR检测MDR1 mRNA的表达,筛选出干扰效率较高的一条siRNA。3.通过注射人卵巢癌细胞SKOV3/AR到裸鼠腹腔建立腹水瘤模型;待裸鼠长有腹水,然后把荷瘤鼠随机分为以下三个治疗组（6只/组）:泰素治疗组（空白组）,泰素和脂质体治疗组（对照组）,泰素和小分子RNA干扰治疗组（治疗组）,三组均为腹腔注射治疗。治疗过程中,每周称量老鼠体重两次,以此评价治疗的毒性反应。4.观察各组老鼠的肿瘤和腹水生长情况,并分别用半定量PCR和免疫组织化学染色法测定治疗后肿瘤组织中MDR1和P糖蛋白的表达情况。结果1.通过图像软件分析荧光显微镜照片显示:当干扰片段浓度为30nM时, siRNA转染效率最高。2.转染48小时后各组细胞MDR1表达水平:MDR1mRNA在siRNA/MDR1-I组、siRNA/MDR1-II组、siRNA/MDR1-III组、空白组、脂质体组及阴性对照组细胞的表达水平依次为1.98±0.03,2.05±0.09,1.45±0.08,3.49±0.28,3.46±0.17和3.48±0.26;同空白组相比,siRNA干扰组MDR1mRNA的表达水平均有显著下降（均有P<0.05）,其中以siRNA/MDR1-III组的下降最明显,因此选择对基因抑制率最高的siRNA/MDR1-III进行后续治疗实验。3.接种细胞20天后,裸鼠被发现有腹水。治疗结束后,我们发现siRNA治疗无明显毒性反应,且泰素和小分子干扰RNA治疗组老鼠的肿瘤及腹水生长与其他组相比明显受到抑制,分别下降了43.6 %和29.7%（P<0.001）;泰素和小分子干扰RNA治疗组肿瘤组织中MDR1和P糖蛋白的表达与其他组相比也明显受到抑制（P<0.001）。结论靶向MDR1基因的小分子干扰RNA能够在体内有效而特异性地抑制MDR1及P糖蛋白的表达和卵巢癌的生长;小分子RNA干扰技术有可能成为卵巢癌基因治疗的一种安全而有效的方法。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验细胞株
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要试剂及产地
• 2.1.4 主要仪器设备及产地
• 2.2 实验方法和步骤
• 2.2.1 SKOV3/AR 细胞的培养
• 2.2.2 检测细胞 MDR1 的表达
• 2.2.3 使用荧光标记的siRNA 测定转染的最佳条件
• 2.2.4 筛选最佳的siRNA/MDR1
• 2.2.5 裸鼠饲养及腹水瘤动物模型的建立
• 2.2.6 动物实验
• 2.2.7 RT-PCR 测肿瘤组织 MDR1 的表达
• 2.2.8 免疫组织化学染色法测肿瘤组织 P-gp 的表达
• 2.3 统计学分析
• 第3章 结果
• 3.1 证实卵巢癌 SKOV3/AR 细胞株 MDR1 的表达
• 3.2 使用荧光标记的siRNA 测定转染的最佳条件
• 3.3 筛选最佳的siRNA/MDR1 片段
• 3.4 腹水瘤动物模型的建立
• 3.5 肿瘤与腹水生长的抑制情况
• 3.6 肿瘤组织中MDR1和P-gp的表达
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果