食品过敏原压电型免疫传感快速检测技术的研究

论文摘要

食品过敏原已成为重要的食品安全隐患,河虾与花生在世界粮油组织FAO（1995年）报告中被列为八大常见过敏食品之一。目前过敏原检测方法操作繁琐,无法满足快速、简便、在线检测的要求。本文以抗原抗体免疫反应和压电型传感技术为基础,建立了食品过敏原的压电型免疫传感快速检测方法。本文首先通过硫酸铵分级沉淀和等电点沉淀制备了河虾、花生蛋白,经凝胶色谱及SDS-PAGE分析,确认河虾及花生的主要致敏组分。将河虾、花生蛋白分别免疫BALB/C小鼠,获得河虾抗体效价为30000,半数抑制率IC50为60ug/mL。花生抗体效价为10000,IC50为150ug/mL。免疫传感方法的研制过程中,选择1,6-己二硫醇（HDT）-纳米金作为自组装方式。检测体系的最佳检测条件为:常温下15mM HDT包被90min,纳米金吸附时间为110min,抗体包被情况为4℃条件下包被3小时,其中河虾抗体包被浓度为1:6000,花生抗体包被浓度为1:4000,检测时间为500s。在蛋白浓度为1ug/mL～300ug/mL之间绘制出免疫传感检测的标准曲线,其频率变化趋势与sauerbrey方程一致。其中河虾蛋白的最低检测限为0.03ug/mL,花生蛋白的最低检测限为0.2ug/mL,具有较高的灵敏度。河虾抗体传感器与鱼蛋白交叉率较高,花生抗体传感器与大豆蛋白的交叉率低,实验结果与ELISA结果一致。对河虾和花生蛋白在纯净水中作回收实验,平均回收率在90%～110%之间,重现性实验的平均变异系数小于15%。对免疫传感器进行再生,再生效果较好的是Piranha溶液和强碱强酸溶液,电极可以重复利用13次之多,甘氨酸再生性相对稍弱,但使用比较方便,可以重复再生5次。综合各因素,本论文建立的免疫传感快速检测方法可以运用于食品检测中,具有一定的实际应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 食品过敏原
• 1.1.1 食品过敏原的种类及其特点
• 1.1.2 食品过敏的机理
• 1.1.3 食品过敏原的安全性评价
• 1.2 食品过敏原的化学分析检测技术
• 1.2.1 利用人血清特异性IgE 检测食品过敏原
• 1.2.2 用单克隆或多克隆抗体检测食品过敏原
• 1.2.3 PCR 分析
• 1.2.4 组胺释放实验（HRT）
• 1.2.5 过敏原指纹图谱快速检测方法
• 1.2.6 过敏原检测方法存在问题与展望
• 1.3 食品过敏原的免疫传感检测技术
• 1.3.1 免疫传感器的组成和原理
• 1.3.2 免疫传感器的分类
• 1.3.3 压电免疫传感器
• 1.4 本课题的意义及主要研究内容
• 1.4.1 研究意义
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 食品过敏原抗体的制备和鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料和试剂
• 2.1.2 主要溶液
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 花生、河虾蛋白的制备
• 2.2.2 硫酸铵分级沉淀
• 2.2.3 等电点沉淀
• 2.2.4 透析
• 2.2.5 考马斯亮蓝法测蛋白浓度
• 2.2.6 凝胶色谱分离鉴定
• 2.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测过敏原分子量：（过敏原纯度分析）
• 2.2.8 过敏症小鼠模型建立
• 2.2.9 抗体效价的测定
• 2.2.10 包被抗原和一抗浓度范围的确定
• 2.2.11 包被抗原、一抗和酶标二抗最佳工作浓度的确定
• 2.2.12 竞争ELISA 标准曲线的制作
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 目的蛋白的分离纯化
• 2.3.2 考马斯亮蓝法测蛋白浓度
• 2.3.3 过敏原蛋白凝胶色谱结果
• 2.3.4 过敏原蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法结果
• 2.3.5 小鼠过敏症状
• 2.3.6 抗体效价的测定
• 2.3.7 包被抗原和一抗浓度范围的确定
• 2.3.8 包被抗原、一抗和酶标二抗最佳工作浓度的确定
• 2.3.9 间接竞争ELISA 标准曲线的制作
• 2.4 讨论
• 2.4.1 动物免疫过程
• 2.4.2 抗血清的保存条件
• 2.5 本章小结
• 第三章 食品过敏原的免疫传感快速检测
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 材料和试剂
• 3.1.2 主要溶液
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 电极的清洗
• 3.2.2 金电极的三种自组装
• 3.2.3 过敏原特异性IgE 包被
• 3.2.4 BSA 封闭
• 3.2.5 免疫传感快速检测结果
• 3.2.6 免疫传感检测的再生性研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 电极的清洗
• 3.3.2 三种自组装的比较
• 3.3.3 HDT-纳米金自组装
• 3.3.4 过敏原特异性IgE 包被
• 3.3.5 BSA 封闭
• 3.3.6 传感器的响应时间
• 3.3.7 绘制标准曲线
• 3.3.8 再生性研究
• 3.4 讨论
• 3.4.1 电极安装的注意点
• 3.4.2 免疫传感器使用的注意点
• 3.5 总结
• 第四章 免疫传感快速检测与ELISA 的比较
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 材料和试剂
• 4.1.2 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 灵敏度
• 4.2.2 特异性
• 4.2.3 回收率
• 4.2.4 重现性
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 灵敏度
• 4.3.2 特异性
• 4.3.3 回收率
• 4.3.4 重现性
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 主要结论
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文