低密度脂蛋白对高糖背景下人腹膜间皮细胞转分化和细胞外基质蓄积的影响及其机制探讨

论文摘要

研究背景腹膜透析是终末期肾病（ESRD）终末期肾病患者重要的治疗措施。终末期肾病患者往往伴随着脂代谢的紊乱,约30-70%透析患者的甘油三酯升高,腹透病人较血透患者高胆固醇血症更为突出,通常表现为TC、LDL-C浓度升高,HDL-C降低。腹膜纤维化是腹透患者腹膜失功的重要原因,具体机制仍不清楚,最近研究认为腹膜间皮细胞转分化和细胞外基质（ECM）的蓄积是腹膜纤维化病变最重要的两个病变,葡萄糖、炎症在其中发挥重要作用,但是目前还没有关于脂质在腹膜间皮细胞转分化、及后续的ECM蓄积和纤维化中作用的报告,具体机制也不清楚。研究目的1.观察维持性腹膜透析患者血脂紊乱特点,观察脂代谢紊乱与腹膜转运状态的关系和对间皮细胞功能的影响；2.明确人腹膜间皮细胞（HPMCs）是否能诱导表达LDL受体,并摄取LDL进入细胞内；3.了解LDL对高糖背景下HPMCs转分化的影响；4.了解LDL对高糖背景下HPMCs细胞外基质蓄积的作用；5.探讨PPARγ在LDL诱导HPMCs转分化和ECM蓄积中的作用。材料、方法及结果一、终末期肾病腹膜透析患者脂质代谢紊乱特点选择2009年3月-9月在北京协和医院透析中心规律腹膜透析（超过3月）的患者127例,维持性血透患者95例,对照组为同期门诊和住院的慢性肾脏病（CKD 3-4期）患者130例,随访2年观察患者的死亡情况。收集患者的临床资料、血生化、透析充分性、氮平衡和腹膜转运特点,测定血脂和载脂蛋白全套（TC、TG、LDL-C、HDL-C、Lp（a）、apoA、apoB）、高敏C反应蛋白、腹透液CA125。随诊2年,分析脂质代谢紊乱与腹透患者生存率、腹透液CA125和腹膜转运特点的关系。结果：1.腹透患者脂代谢紊乱比血透患者显著,TC、LDL-C、apoA、apoB均高于血透患者,且白蛋白更低、iPTH降低；2.尽管CA125与TG和TC相关,自身前后对照相关性很好,但是未发现腹膜的转运状态与腹透液CA125相关,也没发现TC、TG和LDL与腹膜转运方式相关。二、LDL对HMCs转分化、ECM蓄积的影响及其机制探讨1.人腹膜间皮细胞株的培养和鉴定外购HMrSV5人腹膜间皮细胞株（HPMCs）,采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，常规细胞培养、传代、冻存和复苏。倒置相差显微镜观察细胞形态，细胞未融合前表现为圆形、星形和多边形，细胞融合后呈现铺路石样改变。免疫组化检测细胞抗人角蛋白、抗人波形蛋白细胞浆染色阳性、抗人VIQ因子和CD45抗原染色阴性，符合人腹膜间皮细胞特征。2. HPMCs通过LDL受体摄取LDL进入细胞内免疫荧光观察到LDL可以刺激HPMCs细胞表达LDL受体，主要表达在细胞膜上，少量在胞浆内。油红0染色法观察到HPMCs能摄取LDL进入细胞内，细胞内可见明显的颗粒状红染脂滴，加入LDL受体阻断剂乳铁蛋白能抑制LDL进入细胞内，油红0染色阴性。3. LDL对HPMCs转分化的影响不同浓度的LDL（0、25、50、100μg/ml）,刺激HPMCs 24h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，发现随LDL浓度增高，细胞间连接逐渐趋于松散，细胞呈现明显梭形成纤维细胞样形态。免疫荧光法观察到对照组胞浆α-SMA阴性，随LDL浓度增加，胞浆内α-SMA荧光强度逐渐增强。HPMCs分为对照组、甘露醇组、葡萄糖30mmol/L组，葡萄糖120mmol/L组（HG组），HG+LDL组（100μg/ml）,RT-PCR（realtime-PCR）和免疫印迹法（Western blot）观察α-SMA和E-cadherin mRNA和蛋白表达。HG+LDL能明显上调α-SMA mRNA和蛋白表达，降低E-cadherin mRNA的表达。4.LDL对HPMCs细胞外基质合成和降解的影响通过RT-PCR法观察以上各组HPMCs胶原（COL-I）和纤维连接蛋白（FN）mRNA表达，ELISA法测定细胞上清中COL-I蛋白含量。HG+LDL能明显上调细胞上清中COL-I蛋白的表达，COL-I和FN在mRNA水平的检测未观察到各组间的显著差异。RT-PCR法检测到HG+LDL比对照组纤溶酶原抑制物（PAI-1）mRNA水平显著增高，ELISA法检测培养细胞上清PAI-1含量，HG+LDL组也显著高于对照组。5.PPARγ在LDL诱导HPMCs转分化和ECM蓄积影响中的作用RT-PCR和Western blot法分别检测不同刺激组PPARγmRNA和蛋白表达情况,HG+LDL能显著上调PPAR y mRNA的表达。在以上研究中,加入不同浓度的GW9662 （5μg/m1、10μg/ml）,观察到阻断PPARγ配体能改善HG+LDL对HPMCs形态改变、转分化和ECM降解酶抑制物PAI-1的作用。结论在本实验条件下,我们观察到：1.腹膜透析患者脂代谢紊乱重于血透患者,主要表现为TC、LDL-C和apoB升高；2. HPMCs通过LDL受体摄取LDL进入细胞内；3.LDL能在高糖背景下诱导HPMCs发生转分化、分泌COL-I蛋白增加,并通过上调纤溶酶原抑制物PAI-1 mRNA和蛋白表达,抑制ECM降解,促进ECM蓄积；4.LDL可能通过上调HPMCs细胞PPARγmRNA表达来诱导HPMCs转分化和细胞外基质蓄积。

论文目录

• 英文缩写词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 终末期肾病腹腹膜透析患者脂质代谢紊乱特点
• 一、研究方法
• 二、统计学方法
• 三、结果
• 第二部分 LDL对人腹膜间皮细胞转分化和ECM蓄积影响及机制探讨
• 第一节 人腹膜间皮细胞株的培养和鉴定
• 第二节 人腹膜间皮细胞通过LDL受体摄取LDL进入细胞内
• 第三节 LDL对人腹膜间皮细胞转分化的影响
• 第四节 LDL对人腹膜间皮细胞ECM蓄积的影响
• 第五节 PPARγ在LDL对人腹膜间皮细胞转分化和ECM蓄积中的作用
• 讨论
• 结论
• 综述（一） 腹膜间皮细胞转分化在腹膜纤维化中的作用及机制
• 综述（二） PPARγ对脂代谢调控机制的研究
• 参考文献
• 致谢