两种猪源病毒基因图谱绘制及分子免疫研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）和猪2型圆环病毒（Porcine circovirus type 2, PCV2）病是当今养猪业严重关切的两种重大传染病之一,两病的广泛流行和蔓延已给世界各国养猪业的发展造成了严重威胁和经济损失。在现代化规模养猪场中,PCV2与PRRSV往往混合感染,发病率呈上升趋势。为了有效控制这两种传染病的流行,减少由此引起的经济损失,本研究以PCV2和PRRSV当地流行毒株为研究材料,进行了基因克隆、分子结构特征分析、基因图谱绘制、分子诊断、流行病学调查及免疫研究,主要研究成果如下:（1）应用RT-PCR技术,分段克隆了PRRSV GS株基因,采用DNAStar软件将各基因依次拼接,并对其特征进行了分析,绘制了PRRSV GS株全基因图谱和系统进化树。结果表明,该毒株全基因组长15427bp,包含8个阅读框（ORF）,其中5’端非编码区长190bp,与国内外参考毒株核苷酸序列的同源性分别为56.3%～97.9%;ORF1长11882,其中ORF1a长7512bp,与国内外参考毒株核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别为54.3%～98.7%和49%～99.3%,ORF1b长4374bp,与国内外参考毒株核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别为60.8%～95.5%和49%～99.3%;结构蛋白基因长约3819bp,分为6个结构蛋白基因区,与BJ-4、CH-1a、HB-2（sh）/2002和VR-2332美洲株等核苷酸的同源性分别为:ORF2 93.1%～96.6%,ORF3 90.7%～96.5%,ORF4 88.1%～95.5%,ORF5 87.9%～95.0%,ORF6 95.1%～97.1%,ORF7 92.2%～95.7%,推导的氨基酸同源性分别为:ORF2 91.1%～95.7%,ORF3 89.4%～92.5%,ORF4 88.3%～96.6%,ORF5 87.1%～95.0%,ORF6 96%～97.1%,ORF7 90.3%～95.2%;3’端非编码区长151bp,与国内外参考毒株核苷酸序列的同源性分别为70.9%～100%;最后有一个长14个碱基的poly（A）尾。从系统进化树分析,PRRSV GS株同以LV株为代表的欧洲型遗传距离较远,而与以VR-2332株为代表的北美洲型和流行于我国的毒株遗传距离较近,进一步证实了流行于我国的毒株在基因型上属于北美洲型。（2）构建了PRRSV GS株E基因的重组腺病毒质粒,转染AD-293细胞,经荧光检测表明获得了AD-E复制缺陷型腺病毒。用重组腺病毒AD-E免疫小鼠,以间接ELISA和MTT法检测小鼠血清抗体水平和T淋巴细胞增殖情况,结果能刺激T淋巴细胞增殖,但未能检测到小鼠血清中的抗体,其原因有待进一步研究。（3）应用PCR技术对从甘肃猪场分离的3株PCV2毒株进行了全序列测定,其中PCV2 Ww株基因组长度为1768bp,PCV2 LZ和TS株长1767bp,将序列登陆到Genbank获得3个登录

论文目录

• 摘要
• Summary
• 英文缩略表
• 第一章 绪言
• 1.1 研究背景及目的、意义
• 1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪繁殖与呼吸综合征疫苗
• 1.1.2 猪圆环病毒和猪圆环病毒疫苗
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 核酸疫苗
• 1.2.2 活载体疫苗
• 1.2.3 猪繁殖与呼吸综合征的疫苗研究进展
• 1.2.4 猪2 型圆环病毒的疫苗研究进展
• 1.3 研究内容与方法
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因克隆、结构特征分析及基因图谱绘制
• 一、猪繁殖与呼吸综合征病毒5’端非编码区的分子克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 菌种与载体
• 1.4 病毒 RNA 的提取
• 1.5 引物
• 1.6 RT-PCR
• 1.7 PCR 产物的纯化、回收
• 1.8 PCR 纯化产物与pMD18-T 载体连接
• 1.9 感受态细菌的制备
• 1.10 转化感受态细胞
• 1.11 质粒 DNA 的提取
• 1.12 重组质粒的鉴定
• 1.13 5’NCR 的序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR 扩增反应
• 2.2 核苷酸同源性分析
• 2.3 5’NCR 二级结构分析
• 3 讨论
• 二、猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白基因的克隆及其基因特征的分析
• 1 材料和方法
• 1.1 病毒
• 1.2 质粒和菌种
• 1.3 试剂和工具酶
• 1.4 引物
• 1.5 病毒RNA的提取
• 1.6 RT-PCR 反应
• 1.7 目的基因的克隆和鉴定
• 1.8 序列分析
• 2 结果
• 2.1 目的基因的克隆
• 2.2 非结构蛋白基因的序列测定结果
• 3 讨论
• 三、猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因的克隆及其基因特征的分析
• 1 材料和方法
• 1.1 病毒
• 1.2 质粒和菌种
• 1.3 试剂和工具酶
• 1.4 引物
• 1.5 病毒RNA的提取
• 1.6 RT-PCR 反应
• 1.7 目的基因的克隆和鉴定
• 1.8 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 目的基因的克隆
• 2.2 结构蛋白基因的序列测定结果
• 2.3 结构蛋白基因的同源性分析
• 2.4 遗传进化树
• 3 讨论
• 四、猪繁殖与呼吸综合征病毒3’端非编码区的分子克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒
• 1.2 病毒 RNA 的提取
• 1.3 主要试剂
• 1.4 菌种与载体
• 1.5 引物
• 1.6 3’NCR 的分子克隆
• 1.7 目的基因的克隆与鉴定
• 1.8 3’NCR 的序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR 扩增结果及阳性重组质粒酶切鉴定
• 2.2 核苷酸同源性分析
• 2.3 3’NCR 二级结构分析
• 3 讨论
• 小结
• 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒 E 基因腺病毒载体的构建及分子免疫研究
• 1 材料和方法
• 1.1 毒株与细胞
• 1.2 载体及菌株
• 1.3 工具酶及其它试剂盒
• 1.4 细胞培养
• 1.5 病毒 RNA 的提取
• 1.6 E 基因的制备
• 1.7 含感受态细胞的准备
• 1.8 重组腺病毒穿梭载体的构建
• 1.9 重组腺病毒质粒的构建
• 1.10 转染AD-293细胞获得重组腺病毒
• 1.11 RT-PCR 检测重组病毒的产生
• 1.12 动物
• 1.13 小鼠脾脏 T 淋巴细胞制备及T 细胞增殖实验
• 1.14 免疫小鼠血清抗体检测
• 2 结果与分析
• 2.1 E 基因的扩增和重组质粒的酶切鉴定
• 2.2 重组腺病毒穿梭载体的构建
• 2.3 获得复制缺陷型腺病毒质粒
• 2.4 重组腺病毒的收获及鉴定
• 2.5 T 淋巴细胞增殖反应的测定结果
• 2.6 实验小鼠血清中 PCV2 特异性抗体测定
• 3 讨论
• 第四章 三株猪2 型圆环病毒流行毒株基因克隆、结构特征分析及基因图谱绘制
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒样品
• 1.2 载体与菌株
• 1.3 工具酶及其它试剂盒
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 仪器与设备
• 1.6 病毒DNA的提取
• 1.7 病毒DNA 的PCR 扩增
• 1.8 PCR 产物的纯化、回收
• 1.9 PCR 纯化产物与pMD18-T 载体连接
• 1.10 感受态细菌的制备
• 1.11 转化感受态细胞
• 1.12 质粒 DNA 的提取
• 1.13 重组质粒的鉴定
• 1.14 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 各猪场组织病料中 PCV2 的 PCR 检测结果
• 2.2 PCV2 分离株的全基因序列测定与分析
• 2.3 3 株猪圆环病毒2 型核苷酸序列与已发表序列核苷酸同源性比较
• 2.4 三株猪圆环病毒2 型ORF1 核苷酸及推导氨基酸序列同源性比较
• 2.5 三株猪圆环病毒2 型ORF2 核苷酸及推导氨基酸序列同源性比较
• 2.6 三株ORF2 基因编码的氨基酸抗原性和亲水性分析
• 3 讨论
• 第五章 猪2 型圆环病毒核酸载体构建及分子免疫研究
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒及菌株
• 1.2 工具酶及其它试剂盒
• 1.3 引物
• 1.4 目的基因的获得
• 1.5 真核表达质粒获得
• 1.6 免疫用质粒的制备
• 1.7 实验动物
• 1.8 实验分组
• 1.9 实验小鼠T 淋巴细胞增殖反应的测定
• 1.10 免疫小鼠血清抗体水平检测
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR 扩增结果及阳性重组质粒酶切鉴定
• 2.2 T 淋巴细胞增殖反应的测定结果
• 2.3 实验小鼠血清中 PCV2 特异性抗体测定
• 3 讨论
• 第六章 猪2 型圆环病毒Cap 基因的腺病毒载体构建及分子免疫研究
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒及菌株
• 1.2 工具酶及其它试剂盒
• 1.3 引物
• 1.4 目的基因的获得
• 1.5 重组腺病毒穿梭载体的获得
• 1.6 大肠杆菌 JM109 感受态细菌的制备
• 1.7 转化感受态细胞
• 1.8 质粒 DNA 的提取
• 1.9 重组腺病毒载体的鉴定
• 1.10 同源重组获得腺病毒载体
• 1.11 转染 AD-293 细胞获得重组腺病毒
• 1.12 PCR 检测重组病毒的产生
• 1.13 动物
• 1.14 实验分组
• 1.15 T 淋巴细胞悬液的制备及 T 淋巴细胞增殖反应的测定
• 1.16 免疫小鼠血清抗体水平检测
• 2 结果与分析
• 2.1 衣壳蛋白 Cap 基因的扩增
• 2.2 重组腺病毒穿梭载体的构建
• 2.3 获得复制缺陷型腺病毒质粒
• 2.4 荧光显微镜检测报告基因 EGFP 的表达
• 2.5 重组腺病毒质粒转染293 细胞
• 2.6 T 淋巴细胞增殖反应的测定结果
• 2.7 实验小鼠血清中 PCV2 特异性抗体测定
• 3 讨论
• 第七章 结论
• 第八章 文献综述
• 文献综述一：猪圆环病毒研究进展
• 1 病原学
• 2 PCV2 流行病学
• 3 PCV2 感染的病理变化
• 4 PCV2 的致病机理
• 5 PCV2 的诊断技术
• 6 PCV2 的防治
• 7 展望
• 文献综述二：猪繁殖与呼吸综合征研究进展
• 1 病原学
• 2 PRRSV 分子生物学研究
• 3 PRRS 病毒的遗传变异
• 4 流行病学
• 5 临床症状
• 6 病理变化和发病机制
• 7 疫苗免疫及防制策略
• 8 结语
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简历