人表皮干细胞分化成成釉细胞的研究

论文摘要

在组织工程研究领域中,牙齿再生技术的建立已成为该领域的热点。由于牙齿发育模式的独特性和结构相对简单,牙齿再生将会成为可能。牙齿形态的发生和分化,需要上皮来源的细胞和神经嵴来源的间充质细胞相互诱导,同样诱导干细胞再生牙齿也需要上皮源性和间充质源性的细胞参与。目前间充质来源的干细胞很容易获得,像牙髓干细胞,骨髓干细胞都可以被诱导为类牙本质的结构,而胚胎干细胞诱导效率低,获得比较困难,又面临着伦理问题,所以目前在组织工程领域中,成体干细胞成为该领域的研究趋势。本论文的目的是想建立表皮干细胞的分离和培养技术体系,开展诱导人类表皮干细胞制备牙上皮的研究工作。在本实验的研究中,建立了比较完善的表皮干细胞培养体系,并且得出在成纤维培养条件下,有利于表皮干细胞的扩增和表型的维持;在FGF8生长因子诱导条件下,表皮膜片与E13.5的牙间充质细胞重组,重组后的嵌合体移植到裸鼠肾囊膜三周,组织学切片,发现表皮干细胞可以被诱导分化为成釉细胞,并且成釉细胞分泌牙釉质;为了检测嵌合体牙齿中成釉细胞的功能性,本实验检测特异性识别人抗体的Ameloblastin,MMP-20,FGF8,结果说明FGF8生长因子可以诱导表皮干细胞形成有功能的成釉细胞。在实验过程中,发现老鼠牙胚在帽状早期FGF8开始不表达,而人类牙齿从早期到分泌期FGF8都有表达。而在嵌合体牙齿中,FGF8表达很强烈,说明再生出的牙齿趋向于人类牙齿。同时本实验用DSP抗体检测嵌合体牙齿中成牙本质细胞的功能,发现其发分泌的牙本质DSP有强烈的表达。实验过程中,由于成牙率很低,想通过长时期表达FGF8这种生长因子来提高成牙率,所以本实验又构建了长时期表达FGF8生长因子的慢病毒lentiviruse-mfgf8,结果嵌合体也可以成牙,并且表皮干细胞可以被诱导为成釉细胞,虽然成牙率有提高,但是实验次数比较少（两粒有一粒成牙）,对于这一结果有待于进一步研究。总之上皮来源的表皮干细胞可以支持牙齿再生,并且在FGF8的诱导下,可以分化成成釉细胞,分泌釉质。这一结果将为牙齿再生的临床实践奠定理论和技术基础,对于干细胞在组织工程研究领域中的应用研究有普遍意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 目录
• 绪论
• 第一节 牙齿的发育
• 1.1 哺乳动物牙齿发育
• 1.2 哺乳动物牙齿发育的分子机制
• 第二节 组织工程再生牙齿
• 第三节 人表皮干细胞
• 3.1 表皮干细胞在毛囊中的定位
• 3.2 毛囊表皮干细胞的调节
• 3.3 表皮干细胞的标记
• 第四节 病毒载体的应用
• 4.1 RNA病毒载体
• 4.2 DNA病毒载体
• 第一章 材料与方法
• 第一节 材料
• 1.1 菌株与载体
• 1.2 细胞
• 1.3 取材
• 1.4 实验动物
• 1.5 试剂配置
• 第二节 方法
• 2.1 人表皮干细胞分离、培养
• 2.2 人表皮干细胞的鉴定
• 2.3 表皮膜片与间充质细胞重组和培养
• 2.4 PNL-IRES2-EGFP-mfgf8构建
• 2.5 慢病毒的生产
• 2.6 组织块的处理和形态学检测方法
• 2.7 DNA原位杂交
• 2.8 免疫组化
• 第二章 结果
• 第一节 表皮干细胞分离,培养,鉴定
• 1.1 表皮干细胞在皮肤中的定位
• 1.2 表皮干细胞培养体系的建立
• 1.3 表皮干细胞的鉴定
• 第二节 人表皮干细胞牙向分化研究
• 2.1 FGF8生长因子诱导表皮干细胞分化成成釉细胞
• 2.2 嵌合体牙齿中细胞源性的鉴定
• 2.3 嵌合体牙齿中功能蛋白的鉴定
• 第三节 过表达mfgf8对嵌合体牙齿形成的影响
• 3.1 lentiviruse-mfgf8构建
• 3.2 lentiviruse-mfgf8慢病毒生产
• 3.3 嵌合体中过表达FGF8对牙齿发育的影响
• 第三章 分析与讨论
• 第一节 人表皮干细胞体外培养
• 第二节 人表皮干细胞可以支持牙齿再生
• 第三节 FGF8可以诱导表皮干细胞形成有功能的成釉细胞
• 第四章 结论
• 附录1
• 1.鼠牙胚和人牙胚fgf8的表达模式
• 2.质粒图谱
• 3.PNL-IRES2-EGFP-mfgf8测序报告单
• 4.PNL-IRES2-EGFP-mfgf8比对结果
• 附录2英文缩略表
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历