野生型和突变CFTR氯离子通道天然小分子激活剂的发现与分子药理学研究

论文摘要

本文工作的目的是对中药单体化合物荷叶碱和姜黄素的CFTR氯离子通道激活作用进行系统的分子药理学研究,以评价其在治疗CF疾病中的可能性和策略。CFTR由于其突变能导致致命性遗传疾病CF而备受关注,人们对其结构、功能进行大量研究取得了很大成果。目前,寻找能够激活野生型和突变型CFTR功能的小分子调节剂是CFTR有关研究的重点之一。我们实验组在前期实验中利用稳定表达人CFTR和对卤族元素碘离子高度敏感的荧光绿蛋白突变体EYFP-H148Q的Fischer大鼠甲状腺上皮细胞为筛选模型,在中药单体化合物库中发现了大量野生型和突变型CFTR Cl-通道激活剂。在此基础上我们选择了荷叶碱和姜黄素,利用荧光细胞功能测定模型、短路电流测定技术以及细胞膜片钳技术等手段对二者的CFTR氯离子通道激活作用进行系统的分子药理学研究。结果表明,生物碱类化合物荷叶碱对野生型和ΔF508突变型CFTR Cl-通道具有激活作用,而对G551D突变型CFTR Cl-通道无激活作用。黄酮类化合物姜黄素不能纠正ΔF508-CFTR蛋白胞内转运的障碍,但却具有纠正其通道开放障碍的功能;而且姜黄素对G551D突变型CFTR Cl-通道也有激活作用。上述两种化合物对野生型和突变型CFTR Cl-通道的激活作用具有作用迅速、可逆、剂量依赖的特点,上述活性依赖于细胞内cAMP水平而不提高细胞内cAMP水平。机制分析结果显示它们可能是通过与CFTR直接结合而发挥作用的荷叶碱与姜黄素具有多方面药理作用,是对CFTR具有激活作用的天然化合物之一,将在阐明CFTR活性机制及作为先导化合物开发与CFTR有关的疾病治疗药物等方面具有重要用途。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 囊性纤维化（CF）——一种致死性遗传病
• 1.1.1 慢性肺部感染导致肺功能丧失
• 1.1.2 胰腺和肠道功能不全导致消化功能障碍
• 1.1.2.1 CF对胰腺功能的影响
• 1.1.2.2 CF对肠道功能的影响
• 1.2 CF是由于囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）突变造成的
• 1.2.1 CFTR的结构与表达
• 1.2.2 CFTR的功能与调节
• 1.2.3 CFTR突变体的种类
• 1.3 CFTR两种最主要的突变形式
• 1.3.1 ΔF508-CFTR突变造成两种严重后果
• -转运功能的丧失'>1.3.2 G551D-CFTR突变造成Cl^-转运功能的丧失
• 1.4 CF的治疗策略
• 1.4.1 CF没有有效的治疗办法
• 1.4.2 CF治疗的新策略
• 1.5 两种主要突变型CF的治疗策略
• 1.5.1 ΔF508突变型CF的治疗
• 1.5.1.1 纠正ΔF508—CFTR胞内转运障碍
• 1.5.1.2 纠正ΔF508—CFTR通道开放障碍
• 1.5.2 G551D突变型CF的治疗
• 1.6 突变型CFTR激活剂研究现状
• 1.6.1 研究CFTR结构-功能之间关系的重要工具
• 1.6.2 组合化学库来源的小分子激活剂
• 1.6.3 天然化合物在药物发现中的作用
• 1.6.4 中药在药物发现中的优势
• 1.7 本文中研究的中药单体化合物介绍
• 1.7.1 荷叶碱（Nuciferine）
• 1.7.2 姜黄素（Curcumin）
• 1.8 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 中药单体
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 CFTR氯离子通道荧光测定细胞模型的建立
• 2.2.1.1 FRT/YFP-H148Q/I152L细胞系的建立
• 2.2.1.2 FRT/ΔF508-CFTR/YFP-H148Q、FRT/wt-CFTR/YFP-H148Q、FRT/G551D-CFTR/YFP-H148Q细胞模型的建立
• 2.2.2 氯离子通道荧光测定方法
• 2.2.2.1 荧光检测的原理
• -内流速度测定方法'>2.2.2.2 CFTR介导的I^-内流速度测定方法
• 2.2.3 CFTR激活特异性分析
• 2.2.4 化合物毒性分析方法
• 2.2.5 细胞cAMP分析
• 2.2.6 数据统计分析
• 2.2.7 短路电流测定方法
• 2.2.8 全细胞膜片钳（Whole-cell Patch Clamp）测定法
• 2.2.9 姜黄素稳定性分析
• 第三章 结果分析
• -通道激活作用分析结果'>3.1 荷叶碱对野生型和突变型CFTR Cl^-通道激活作用分析结果
• -离子通道开放'>3.1.1 荷叶碱促进ΔF508-CFTR Cl^-离子通道开放
• -离子通道激活作用的量-效分析'>3.1.1.1 荷叶碱对ΔF508-CFTR Cl^-离子通道激活作用的量-效分析
• -通道活性特异性分析'>3.1.1.2 荷叶碱激活ΔF508-CFTR Cl^-通道活性特异性分析
• 3.1.2 荷叶碱促进wt-CFTR氯离子通道开放
• 3.1.2.1 荷叶碱对wt-CFTR氯离子通道激活作用的量-效分析
• -通道活性特异性分析'>3.1.2.3 荷叶碱激活wt-CFTR Cl^-通道活性特异性分析
• -通道没有激活作用'>3.1.3 荷叶碱对G551D-CFTR Cl^-通道没有激活作用
• -通道的动力学和可逆性分析结果'>3.1.4 荷叶碱激活CFTR Cl^-通道的动力学和可逆性分析结果
• -通道的作用机制研究'>3.1.5 荷叶碱激活CFTR Cl^-通道的作用机制研究
• 3.1.5.1 FSK依赖性分析
• 3.1.5.2 荷叶碱对细胞内cAMP水平的影响
• 3.1.5.3 细胞内cAMP浓度达到最大时荷叶碱对CFTR的激活作用
• 3.2 姜黄素促进ΔF508-CFTR氯离子通道开放
• 3.2.1 姜黄素不能纠正ΔF508-CFTR上膜转运障碍
• 3.2.1.1 荧光测定结果
• 3.2.1.2 短路电流测定结果
• -通道开放障碍'>3.2.2 姜黄素能纠正ΔF508-CFTR Cl^-通道开放障碍
• 3.2.2.1 荧光测定结果
• 3.2.2.2 短路电流测定结果
• 3.2.3 姜黄素稳定性分析
• -通道开放'>3.2.4 姜黄素促进G551D-CFTR Cl^-通道开放
• 3.2.4.1 姜黄素对G551D-CFTR氯离子通道激活作用的量-效分析
• 3.2.4.2 短路电流测定结果
• 3.2.4.3 全细胞膜片钳实验结果
• -通道的动力学和可逆性分析结果'>3.2.4.4 姜黄素激活G551D-CFTR Cl^-通道的动力学和可逆性分析结果
• -通道的作用机制分析'>3.2.4.5 姜黄素激活G551D-CFTR Cl^-通道的作用机制分析
• 第四章 讨论
• 4.1 荷叶碱对CFTR氯离子通道激活作用的分子药理学机制
• 4.2 姜黄素活性结果存在较大差异的原因
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历