利用AFLP技术分析果蝇黑疱翅突变体

论文摘要

果蝇是重要的模式生物。黑疱翅果蝇突变体的卵、幼虫、蛹的形态与野生型黑腹果蝇及黑腹果蝇的黄身突变体无明显差别。根据其成虫的平均寿命、黑色素的分布和翅形可分为几大类,其基本类型为三种:黑疱翅突变型、焦翅突变型和长翅突变型。突变型果蝇中存在中间类型,即在羽化过程中,个体表型发生变化。现有的研究表明,黑疱翅果蝇的寿命明显比野生型黑腹果蝇短,也明显短于亲本黄身果蝇。黑疱翅果蝇类型能够稳定遗传而且多代自交不能纯合,同时又存在着致死突变体。AFLP是继RFLP、RAPD之后发展最快的DNA指纹技术。该方法综合了RFLP和RAPD的特点,具有RFLP的可靠性和RAPD的高效性。AFLP DNA用样量少,灵敏度高,可以在一个反应中检测大量的限制性片段。AFLP最大的优点是能够在短时间内检测出DNA样品间的细微差别,另外一个优点是一对引物所检测到的多个位点随机分布在多条染色体上。不需要事先知道DNA序列信息的情况下,可以同时进行多数DNA酶切片段的PCR扩增,因此被认为是迄今为止最有效最理想的一种DNA分子标记技术。本文采用限制性片段扩增长度多态性（AFLP）技术检测了黑疱翅突变型与亲本黄身果蝇基因组的差别。选取出的64个引物组合对2个果蝇品种进行筛选,最终获得12条差异片段。结果如下:1#片段在Sema-5c（CG5661-PA）和CG17154-PA之间,Sema-5c编码蛋白产物的分子生物学功能包括:信号受体活性,受体结合,催化活性和铁离子结合活性,其参与的生物学事件包括:引导轴突发育,胚的发育,细胞表面受体介导的信号转导,胞间联接,外胚层发育和芳香化合物的新陈代谢过程。已报道有6个等位基因. CG17154是蛋白编码基因,分子生物学功能未知。3#位于基因CG11200中,基因CG11200编码还原型辅酶ⅡNADPH,有3个等位基因。5#位于基因jing的非编码区中,jing基因分子功能有:转录抑制活性,ATP结合活性,H离子转运ATP合成酶活性,锌离子结合活性等。参与的生物学过程包括体节的分化,ATP合成偶联的离子转运,中枢神经的发育,成虫盘翅脉的发育等。8#片段3号L臂上CG6083内,CG6083编码蛋白有乙醛还原酶活性,参与果蝇蘑菇体的发育过程。9#定位于3号L臂上的desert基因内,desert功能未知。11#定位于果蝇2R的CG12758 sano基因内,已报道12个等位基因,生物学功能未知。17#定位于3L的Tenascin major CG5723基因内,该基因产物有结构分子活性,参与包括细胞联接,细胞形态调节的过程。已报道34个等位基因,表现性分别属于13个类别。18#定位于3L的sodium chloride cotransporter 69（Ncc69） CG4357内,Ncc69的功能包括氯化钠协同转运活性,阳离子穿膜转运活性和胺类的穿膜转运活性。参与氨基酸、钠离子和氯化物的转运过程。已报道2个等位基因。19#定位在2R的CG18375中,CG18375分子活性有转录辅因子活性,转录活性调节活性。参与细胞凋亡,细胞周期和细胞周期进程的调控过程。已报道9个等位基因。24#在2R上CG12934和StIP之间。29#位于2R上muscleblind（CG33197）区域内,muscleblind的分子功能有核酸结合活性,与DNA、mRNA和锌离子结合活性,参与的生物学过程有:胚的发育,肌肉发育,外周神经系统发育,躯干肌肉发育,中胚层发育,复眼中光感受细胞的分化等过程。已报道27个等位基因,分别属于16种不同的表现类型。33#片段在果蝇3R基因Antennapedia的非编码区。分子功能有:专一的RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性,与特定DNA序列结合和转录因子活性。生物学功能包括:体节形成,果蝇触角发育,中肠发育,调控RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录,体节的分化,心脏的发育,淋巴腺的发育。已报道142个等位基因,各种表型分别属于76个类别。从分布上看,12条差异片段位于果蝇2号和3号染色体的不同位点。从功能上看,差异片段相关的基因多数是参与果蝇的发育过程的。这些结果说明黑疱翅突变体表型的差异是由不同染色体上的多个位点突变造成的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 综述
• 1 果蝇先天性免疫的研究
• 1.1 体液免疫中的信号转导通路
• 1.1.1 Toll/Dif 信号转导通路
• 1.1.2 Imd/Relish 信号通路
• 1.2 果蝇细胞免疫
• 1.2.1 血浆细胞和吞噬作用
• 1.2.2 薄层细胞和包被作用
• 1.2.3 粒细胞和黑化作用
• 2 分子标记（Molecular markers）
• 2.1 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 2.2 RAPD （Random Amplified Polymorphic DNA）
• 2.3 SCAR（sequence characterized amplified region）
• 2.4 SSR（Sequence Simple Repeat）或Microsatellite 标记
• 2.5 ISSR（inter-SSR）
• 2.6 STS（sequence-tagged site）
• 2.7 CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences）
• 2.8 AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）
• 2.8.1 模板DNA 的制备
• 2.8.2 模板DNA 的扩增反应
• 2.8.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 2.9 SNPs（Single-Nucleotide Polymorphisms）
• 2.10 ESTs（Expressed Sequence Tags）
• 3 分子标记技术在昆虫科学中的应用
• 3.1 分子连锁图的构建
• 3.2 特定基因的标记和定位
• 3.3 分子标记辅助育种
• 3.4 绘制指纹图谱
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 模板DNA 的制备
• 2.2 模板DNA 的扩增
• 2.3 扩增产物的电泳分析
• 2.4 银染显色
• 2.5 差异片段的回收、克隆和鉴定
• 实验结果
• 1 果蝇基因组DNA 的提取
• 2 双酶切效果检测
• 3 AFLP 产物电泳检测
• 3.1 选扩产物的琼脂糖凝胶电泳
• 3.2 选扩产物的PAGE 胶电泳
• 4 二次PCR 电泳图
• 5 阳性克隆的质粒电泳
• 6 测序结果的blast 检索
• 6.1 从各条片段的blast 结果来看:
• 6.2 具体比对结果
• 分析与讨论
• 1 黑疱翅果蝇的杂交结果分析
• 2 AFLP 的影响因素
• 3 AFLP 结果分析
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 后记（含致谢）
• 攻读学位期间取得的科研成果清单