陈美静林锦清（福建省福清卫生学校350300）
【摘要】目的建立系统性念珠菌病小鼠模型。方法将小鼠随机分成2组，实验组经尾静脉注射对数生长期白念珠菌酵母细胞（1×106CFU/ml），正常对照组注射等量的PBS磷酸盐缓冲液。进行小鼠死亡率观察；小鼠肾脏、脾脏组织白念珠菌培养、鉴定；将肾脏组织做病理学标本PAS染色。结果实验组小鼠的死亡率为100%；实验组肾脾组织培养有白念珠菌生长；肾组织病理学检查发现炎性肉芽肿形成，肉芽肿内有大量的白念珠菌孢子和菌丝生长及炎细胞浸润。结论直接将适量的白念珠菌酵母细胞经尾静脉注射入小鼠体内可以建立稳定的系统性念珠菌病小鼠模型，避免了应用免疫抑制剂所导致的人为性实验干扰因素，更好地为系统性念珠菌病的研究提供了动物模型。
【关键词】小鼠念珠菌病动物模型
免疫抑制剂、激素、抗生素的广泛使用及肿瘤、艾滋病等疾病的增加，使系统性念珠菌病的发病率和死亡率明显升高。系统性念珠菌病的治疗仍然是临床医生的一个难点。建立系统性白念珠菌病小鼠动物模型，将有助于对白念珠菌的毒力及其宿主细胞的相互作用机制、致病性及新药的研发等方面进行更深入的研究。
1实验材料
1.1实验动物雄性昆明株小鼠，6～8周龄，18～20克，常规条件饲养，实验前12小时禁食，4小时禁水。
1.2菌种及培养基白念珠菌CAF-2，由华盛顿乔治敦大学医学中心赠送。YPD液体培养基（2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母提取物）；YPD固体培养基（2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%琼脂）；PBS磷酸盐缓冲液；沙堡琼脂培养基SDA（4%葡萄糖，1%蛋白胨，2%琼脂）。
2实验方法
2.1白念珠菌的培养及悬菌液的制备
将白念珠菌在YPD固体培养基上进行传代培养，30℃培养48h后移到4℃冰箱中保存。在感染小鼠之前，挑取一个菌落接种到YPD液体培养基中30℃条件下振荡培养16h至对数生长期。离心（1500rpm10min）后PBS洗涤菌液三次，台盼蓝染色法判断白念珠菌株活力，并用血细胞计数板计数，PBS将白念珠菌细胞调到合适的浓度（2×106CFU/ml）感染小鼠[1]。
2.2动物分组及动物模型的建立
将健康小鼠42只随机分成2组，每组21只。实验组通过小鼠尾静脉注射白念珠菌酵母细胞0.5ml（1×106CFU/ml），对照组注射等量的PBS磷酸盐缓冲液。每天2次观察小鼠的发病情况，CO2吸入法处死濒死状态的小鼠[2,3]。
2.3检测指标
2.3.1小鼠发病情况的观察
每天两次观察小鼠一般情况（活动状态、精神、嗜食情况及体重等）和死亡情况，并将小鼠死亡率进行统计学分析。
2.3.2肾脏、脾脏组织白念珠菌培养
无菌条件下取出小鼠的肾脏和脾组织，称重，3.0mlPBS匀浆处理。100ul匀浆液涂布在每毫升添加50ug链霉素的沙堡培养基上。平皿30°C培养24至36小时，对菌落进行鉴定[4]。
2.3.3组织病理学检查
小鼠肾脏组织用10%中性福尔马林固定，经脱水、透明、石蜡包埋后，4um厚切片，将标本做PAS染色，光学显微镜镜下观察肾组织变化。
2.4统计学处理小鼠死亡率资料用百分率表示，其组间比较进行卡方检验，p＜0.05为差别，有显著性意义。
结果
1.小鼠发病情况的观察
实验组小鼠在观察期间活动减少、精神萎靡，食欲下降、体重减轻，发病率100%。正常对照组小鼠无明显变化，观察期全部存活（见表1）。将小鼠死亡率进行统计学分析，有显著的统计学意义（p＜0.05）。
表1小鼠死亡率的比较
2.小鼠肾脾组织白念珠菌培养结果
实验组小鼠肾、脾组织匀浆涂布的沙堡培养基中长出圆形、柔软光滑、湿润似奶酪样菌落，与CAF-2菌落相同。显色琼脂基上呈绿色菌落。厚膜孢子试验及糖发酵实验证实为白念珠菌。对照组无菌落生长。
3.组织病理学检查结果
实验组小鼠肾组织小管区显微镜下观察见炎性肉芽肿形成，病灶内可见大量白念珠菌菌丝、孢子及中性粒细胞浸润。对照组小鼠肾组织肾小球和肾小管结构完整，无明显病变（见图1）。
讨论
有关系统性念珠菌病的动物模型，国内常在感染动物前应用醋酸可的松或环磷酰胺等免疫抑制剂，抑制动物的免疫力来提高其对白念珠菌的易感性[4]。这一方法人为地增加了实验的干扰因素，使实验的检测指标和结果受到不同程度的影响。本实验结合国内外相关文献，直接将适量的白念珠菌酵母细胞经尾静脉注射入小鼠体内，结果显示，实验组小鼠发病率、肾脾组织CFU检测及组织病理学检查都与正常组有非常显著性差异，而且与感染前使用免疫抑制剂造模的小鼠表现一致。这表明该模型非常成功、可靠，同时避免应用免疫抑制剂所引起的人为的实验干扰因素。更有利于白念珠菌毒力、发病机制及免疫学等方面的研究，也为新型抗真菌药物的研发提供了极好的动物模型。
参考文献
[1]Kozel,T.R.,etal.,AvirulenceofCandidaalbicansCaHK1MutantsinaMurineModelofHematogenouslyDisseminatedCandidiasis.1999,AmSocMicrobiol.p.4280-4284.
[2]Barbieri,J.T.,etal.,AttenuationofVirulenceandChangesinMorphologyinCandidaalbicansbyDisruptionoftheN-AcetylglucosamineCatabolicPathway.2001,AmSocMicrobiol.p.7898-7903.
[3]Kozel,T.R.,etal.,DefectiveHyphalDevelopmentandAvirulenceCausedbyaDeletionoftheSSK1ResponseRegulatorGeneinCandidaalbicans.2000,AmSocMicrobiol.p.518-525.
[4]杨琼,宋祥福,王桂云,系统性白色念珠菌感染小鼠动物模型的研究.2005.p.86-89.