导读:本文包含了胞外丝氨酸蛋白酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:盾壳霉,核盘菌,丝氨酸蛋白酶基因,重寄生
胞外丝氨酸蛋白酶论文文献综述
余涵,王永春,吴明德,张静,李国庆[1]（2016）在《生防菌盾壳霉胞外丝氨酸蛋白酶基因的克隆与功能研究》一文中研究指出盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的一种重寄生菌,该菌对核盘菌专性寄生,作用时间久,而且与核盘菌的生物学特性相似,对植物无致病性,因而具有广阔的应用前景。实验室前期研究证实盾壳霉重寄生核盘菌过程中会分泌大量胞外丝氨酸蛋白酶。本研究利用同源序列比对,通过简并引物扩增,获得丝氨酸蛋白酶基因(CmSp)片段,比对盾壳霉基因组数据库获得11个盾壳霉丝氨酸蛋白酶基因,经过信号肽筛选和表达模式分析,最终筛选到2个受核盘菌菌核提取物诱导上调表达基因CmSp1和CmSp2。其中CmSp1基因全长1335bp,有4个外显子3个内含子,而CmSp2全长1407bp,没有内含子。这两个丝氨酸蛋白酶基因均属于类枯草杆菌蛋白酶S8超家族,活性中心均含有Asp/Ser/His催化叁联体。进一步通过Split-Marker技术成功获得CmSp1和CmSp2敲除转化子,发现只有CmSp1敲除转化子的胞外蛋白酶活性显着降低,而CmSp2敲除转化子胞外蛋白酶活没有显着变化。对各转化子的生物学特性进行研究发现,CmSp-1和CmSp2对盾壳霉的菌丝生长和产孢均没有显着影响。平板对峙及沙皿寄生核盘菌菌核试验结果表明:CmSp1的缺失会导致盾壳霉对核盘菌菌丝和菌核寄生能力的显着下降,而CmSp2的缺失对盾壳霉的重寄生能力没有显着影响。可见,CmSp1在盾壳霉的重寄生过程中起重要作用。(本文来源于《中国植物病理学会2016年学术年会论文集》期刊2016-08-05）
赵海龙,孟庆玲,乔军,陈双庆,王国超[2]（2014）在《少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶P186基因的克隆、序列分析及表达》一文中研究指出引言寄生性线虫对畜牧业的生产发展可以产生巨大的影响。食线虫性真菌是线虫的自然天敌,它们能捕食活的线虫和寄生在虫卵里,把它们当作自己的营养来源,因此这种生物防控方法日益受到各国学者的广泛关注。少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)作为捕食线虫性真菌最具代表的一种模式真菌,被广泛地用于研究捕食线虫性真菌与宿主线虫的相互作用。Liang等(2013年)研究发现在少孢节丛孢菌(本文来源于《中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集》期刊2014-11-08）
赵海龙,孟庆玲,乔军,陈双庆,王国超[3]（2014）在《少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶P186基因的克隆、序列分析及表达》一文中研究指出根据GenBank中少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶P186基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR扩增获得目的基因片段,构建重组表达质粒pET32a-P186,转化到大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行了诱导表达。结果表明,P186基因cDNA全长为1 224 bp,编码407个氨基酸,其中第1~21位为信号肽序列,氨基酸序列的第156~167位、192~202位、343~353位分别是天冬氨酸(Asp160)、组氨酸(His192)、丝氨酸(Ser345)活性位点所在区域,属于Subtilase家族,包括2个潜在的N-联糖基化位点(Asn249、Asn342)及与底物结合的S1区(SBP)Ser251Ile252Gly253和Ala277Ala278Gly279。SDS-PAGE分析结果显示,表达产物的分子质量约为62 kDa。Western Blot分析结果表明,P186重组蛋白可以与抗蛋白粗提液多克隆抗体发生反应。为了揭示少孢节丛孢菌捕食线虫的分子机制,首次克隆并表达了少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶P186基因,为进一步研究丝氨酸蛋白酶P186的生物学功能奠定了基础。(本文来源于《华北农学报》期刊2014年04期）
王俊伟[4]（2013）在《少孢节丛孢菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶的基因克隆、表达及其杀线虫活性研究》一文中研究指出家畜消化道线虫病是一类严重危害动物养殖业持续健康发展的寄生虫疾病，每年给我国畜牧业造成巨大的经济损失。目前，对家畜消化道线虫病的防治主要依靠化学驱虫药物，但长期使用易使虫体产生抗药性，降低药效；同时，动物性食品中的药物残留不但影响人类的身体健康还会对生态环境造成污染。为了克服化学药物防控带来的弊端，国内外相继开展了家畜线虫病生物防控研究，通过线虫的天敌—捕食线虫性真菌及其侵染线虫过程中分泌的毒力因子（胞外蛋白酶）来控制线虫病已经显示出巨大的应用潜力，被认为是一种人-动物-环境友好型线虫病生物防控方法。因此，分离捕食线虫性真菌、研究其侵染线虫的胞外蛋白酶对于家畜消化道线虫病的科学防控具有重要意义。本研究以具有强捕食线虫活性的少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-XAo1为研究对象，克隆了其侵染性丝氨酸蛋白酶XAoz1、P12和P186的基因，进行了生物信息学分析；将丝氨酸蛋白酶XAoz1基因克隆入酵母表达载体中，在毕赤酵母系统诱导表达，对表达的重组蛋白酶开展了杀线虫活性分析。该研究揭示了少孢节丛孢菌XJ-XAo1株在侵染线虫过程中分泌的毒力因子XAoz1的基因结构特征，分析了重组蛋白酶reXAoz1酶学特性并测定了其杀线虫活性，为研制防控家畜消化道线虫病的新型蛋白酶喷洒生防制剂奠定了理论基础。研究方法和主要结果如下：1.少孢节丛孢菌胞外丝氨酸类蛋白酶的基因克隆及序列分析：以捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-XAo1为供试菌株，采用PCR方法成功克隆了XAoz1、P12和P186叁个丝氨酸蛋白酶的DNA基因（GenBank登录号分别为JF747254、JX898768和JX898769），并对基因进行了生物信息学分析，与国内外捕食线虫性真菌分离株进行了序列同源性分析，构建了系统进化树。结果成功克隆了XAoz1（1344bp）、P12（1429bp）和P186（1468bp）的基因。XAoz1、P12各含1个内含子，P186有3个内含子，内含子均以GT开头，AG结尾；它们都含有丝氨酸蛋白酶催化中心叁联体结构域—XAoz1：Asp164、His203、Ser353，P12：Asp193、His230、Ser383，P186：Asp160、His192、Ser345；以及2个与底物结合的S1区—XAoz1：Ser259Leu260Gly261和Ala285Ala286Gly287，P12：Ser289Leu290Gly291和Ala315Ala316Gly317，P186：Ser251Leu252Gly253和Ala277Ala278Gly279。另外，还具有潜在的糖基化位点。XAoz1与已报道PII、Aoz1同源性高（97.5%、98.3%），亲缘关系较近，提示XAoz1与PII、Aoz1可能是少孢节丛孢菌（A.oligospora）在不同环境条件下表达的同功酶或同源基因的类似物；P12、P186分别与PII、Aoz1亲缘关系较远，且XAoz1、P12、P186叁者之间亲缘关系也较远。2.少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶XAoz1在毕赤酵母系统的表达：通过RT-PCR方法扩增了XAoz1成熟肽的cDNA基因，用酶切方法构建了重组表达质粒pPIC9K-XAoz1，线性化后电击转化表达宿主毕赤酵母GS115。结果经过PCR、表型及G418抗性筛选，成功获得具有G418抗性（1.0mg/mL）且表型为His+Mut+的阳性重组酵母转化子；阳性转化子经1.5%甲醇诱导培养72h，重组蛋白酶（reXAoz1）的酶活性达到最大（12168U/mg蛋白）；SDS-PAGE和Westernblot显示表达上清中有约50kDa的特异性条带；reXAoz1能降解酪蛋白、脱脂乳、BSA、明胶、变性胶原和线虫表皮等蛋白底物，提示reXAoz1具有酶活性。3.重组丝氨酸蛋白酶的纯化及杀线虫活性分析：重组毕赤酵母GS115/pPIC9k-XAoz1经过1.5%甲醇诱导培养72h后，其发酵液通过离心、超滤浓缩和His-Bind层析柱纯化步骤后，对分离获得的分析纯重组蛋白酶reXAoz1进行了杀线虫活性分析。结果表明，reXAoz1在50℃、pH6.5～9.5的条件下酶活性较高且稳定，pH8.5时达到最高峰；该重组酶作用的底物范围较宽，能降解酪蛋白、脱脂乳、BSA、明胶、变性胶原和线虫角皮等；reXAoz1对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）和捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）分别作用12h、24h和36h后，对C.elegans的杀灭率为52%、85%、100%，对H.contortus的杀灭率为45%、70%、83%，提示reXAoz1能有效降解线虫体壁，破坏线虫组织结构进而杀灭线虫。(本文来源于《石河子大学》期刊2013-06-01）
张念章[5]（2011）在《副猪嗜血杆菌hhdA基因缺失株的构建及胞外丝氨酸蛋白酶免疫原性的研究》一文中研究指出副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪上呼吸道的常在菌。其致病菌在一定条件下可引起以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征的革拉泽氏病(Glasser’s Disease)。近年来,该病在保育猪群中的发生逐年上升,已成为危害养猪业的重要传染病之一,受到人们的日益重视。虽然近几年加大了该病原的研究力度,筛选出大量的毒力相关基因,但目前为止尚不十分清楚HPS的致病机理。本研究利用重迭PCR(overlapping PCR)的方法构建了HPS hhdA基因的外源打靶基因Hup-Kan-Hdown。将其连接至自杀性质粒载体pDS132,获得了可在宿主菌E.coli SM10λpir中稳定遗传的外源打靶载体pDS-HPhhdA-Kan。将该打靶载体用电转法导入HPS中,经卡那霉素抗性筛选和蔗糖负筛选,得到HPS hhdA基因缺失株(HPS hhdA)。生化试验表明,该突变株的生化特性及NAD生长依赖性未见改变。生长曲线的测定表明该突变株的生长慢于标准株。豚鼠感染试验表明毒力变化不明显。说明hhdA基因不影响HPS的生长、繁殖,与其致病力无明显相关性。本试验建立的HPS遗传操作突变系统为实验室日后验证HPS各种基因功能奠定基础。本研究对HPS的一种胞外丝氨酸蛋白酶(extracellular serine protease, esp)进行了序列分析并将该蛋白进行原核表达。HPS esp一级结构分析表明,前23个氨基可能为信号肽序列。C端转运单位氨基酸序列的系统进化树表明,该蛋白与流感嗜血杆菌中IgA蛋白酶的亲缘关系较近。承载结构域抗原表位的分析表明,50～57、95～108、120～130、185～196、230～241和421～425等6个氨基酸序列表位抗原的可能性较大。将克隆的esp基因连接至表达载体pET30a,构建了表达质粒pET-esp。将测序鉴定正确的重组表达质粒利用IPTG进行诱导表达。经大量诱导条件优化试验,得到了IPTG终浓度为0.6 mmol/L,32℃振荡培养6 h的最优表达条件。SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量约为82 kDa。以该蛋白为抗原,加入等体积的206佐剂免疫豚鼠,3次免疫后以浓度为5×10~9 CFU/mL的菌液进行攻击试验,每只豚鼠注射1 mL。结果表明,esp可以部分保护HPS的感染(6/12),有望成为HPS病免疫诊断和疫苗研制的候选抗原。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2011-06-01）
程古月[6]（2010）在《高温放线菌CDF芽胞表面蛋白酶及胞外丝氨酸蛋白酶的性质和功能研究》一文中研究指出从武汉大学的土壤中分离得到一株嗜热放线菌,通过16S rRNA基因序列分析鉴定该菌属于高温放线菌属(Thermoactinomycse),并将其命名为高温放线菌CDF (Thermoactinomyces sp. CDF)。在该菌产生的芽胞上检测到蛋白酶活性,对其中一种与芽胞相关的枯草杆菌蛋白酶(蛋白酶CDF)的基因进行了克隆,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)中进行了表达。经同源序列比对分析,该酶属于枯草杆菌蛋白酶家族(subtilisin family),具有该家族成员所共同具备的的叁个活性残基(Asp36、His69和Ser223),但该酶不能归类于该家族中已知的任何一个亚家族。重组酶CDF的酶原首先在自身活性中心的介导下经过分子内作用切除N端的85个氨基酸残基(N1)形成中间体(I),再通过分子间的相互作用切除中间体N端的9个氨基酸而形成最终的成熟酶(M)。完整的N端前肽(N2,94个氨基酸)可以抑制该酶的活性并且减缓其加工的速度。高pH条件可以加快蛋白酶CDF的加工,位于N端前肽的Glu(-7)可能作为一个pH感受器发挥作用,当将其突变为Gln,Lys或Ala后,在中性pH条件的表达产物即可出现成熟酶,而野生型和突变体E(-7)D的表达产物在该条件下维持酶原状态。该酶的最适反应温度为50～55℃,最适pH值为10.5-11.0,且在碱性和NaCl存在的条件下有较好稳定性,在4 M NaCl中仍然保留有60%以上的酶活性。免疫杂交显示蛋白酶CDF存在于高温放线菌CDF的芽胞表面,并可以被2M KCl洗脱下来。与芽胞结合的蛋白酶CDF比游离的重组蛋白酶CDF的稳定性高。初步研究表明,蛋白酶CDF并非芽胞萌发所必需,其是否参与芽胞形成或／和萌发过程仍有待深入研究。此外,高温放线菌放线菌CDF的菌丝体和芽胞可以引起人胚肺成纤维细胞WI-38的白介素IL-6分泌量升高。另外,本研究还发现该酶基因的上下游还至少存在八个与芽胞形成相关的基因。到目前为止,蛋白酶CDF是第一个在Thermoactinomyces属中发现的定位于休眠芽胞表面的蛋白酶。在本研究中,我们还从高温放线菌CDF的培养液上清中分离纯化得到一种蛋白酶(蛋白酶C2),其成熟酶大小约为30 kDa。通过CODEHOPs PCR和TAIL-PCR获得了该酶的基因。结果显示,该酶与已报道的来自Thermoactinomyces sp. E79的嗜热蛋白酶的基因序列同一性达100%[1],但两者基因的上游序列却不相同。将该酶的基因在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中进行表达,表达产物以酶原和成熟酶的形式存在于细胞的可溶与不可溶成分中,通过高温或碱性溶液分别处理细胞可溶性蛋白和包含体,均可得到较纯的具有高活性的成熟酶。蛋白酶C2可降解多种可溶及不可溶的大分子蛋白质底物,其降解角蛋白的能力与蛋白酶K相当。同时,该酶还可以在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilisWB700中表达并分泌至胞外。该酶对高温、碱、变性剂等具有较强耐受能力,与商品化的洗涤剂兼容性好,并且具有降解角蛋白和胶原蛋白的能力,在制革、羽毛废弃物处理、食品加工以及洗涤添加剂方面具有应用潜力。(本文来源于《武汉大学》期刊2010-05-01）
邹成钢,屠惠慧,张克勤[7]（2008）在《PacC基因调控粉红螺旋聚孢霉胞外丝氨酸蛋白酶基因PrC的表达》一文中研究指出线虫对农作物和林木造成巨大的危害。由于长期和大剂量的施用农药会造成巨大的环境污染,因此,线虫的生物防治就显得有十分重要。众所周知,食线虫真菌是病原线虫的重要天敌。研究表明,真菌侵染线虫的关键作用机制是分泌毒性因子-胞外丝氨酸蛋白酶,降解线虫体壁,帮助真菌侵染线虫并最终利用降解产物作为自己的营养来源。以前我们实验室在一株捕食线虫真菌粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)中,克隆了一个的胞外丝氨酸蛋白酶基因,命名为PrC。我们的研究发现,PrC基因的表达受pH值影响。(本文来源于《2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集》期刊2008-11-07）
徐赤宇,温海,王溪涛,朱红梅,顾菊林[8]（2006）在《新生隐球菌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶活性检测》一文中研究指出目的:测定不同孵育条件、来源和血清型的新生隐球菌分泌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性。方法:30℃和37℃下用含有偶氮白蛋白的琼脂培养板培养不同来源及血清型的36株新生隐球菌菌株,测量其产生的廓清晕环的大小,计算CH值[菌落半径/(菌落半径+廓清晕环半径)]来比较其胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性强弱;用丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂观察两种酶活性改变;酶谱法观察菌株浓缩上清液中胞外蛋白水解酶活性和相对分子质量。结果:36株菌株在30℃和37℃培养条件下它们的平均CH值分别为0.558±0.170和0.575±0.169,两者间无显着差异;血清A(n=13)、B(n=13)、D/AD(n=6)型菌株各自的平均CH值分别为0.564±0.144、0.515±0.078和0.482±0.072,各组间无显着差异;临床分离株(n=23)、环境分离株(n=9)和荚膜缺陷株(n=4)各自的平均CH值分别为0.570±0.177、0.513±0.069和0.942±0.075(P<0.05)。对照组(不含抑肽酶)和抑肽酶不同浓度组(1.2、1.6 mU)的平均CH值分别为0.459±0.188,0.975±0.287、0.733±0.252(P<0.01)。菌株浓缩液中含有复杂的胞外蛋白酶类成分。结论:新生隐球菌胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶的活性在30℃、37℃下无显着差异;在临床分离株中比环境分离株和荚膜缺陷株强;在不同血清型菌株间无显着差别;可被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制。(本文来源于《第二军医大学学报》期刊2006年02期）
石鑫,杨晓野,杨莲茹[9]（2005）在《杀线虫真菌——少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶的研究进展》一文中研究指出在家畜寄生性线虫的生物控制中熏利用杀线虫真菌——少孢节丛胞菌在侵染线虫过程中分泌的胞外蛋白酶熏固定线虫并降解其体壁已显示出巨大的应用潜力。近年来,国外学者主要研究了杀线虫真菌胞外蛋白酶,特别是对少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶基因PⅡ的分离、测序分析、诱导和利用基因工程技术对该蛋白酶基因克隆和异源表达进行了研究。笔者对杀线虫真菌少胞节丛孢菌的研究进展作了阐述。(本文来源于《畜牧与饲料科学》期刊2005年06期）
胞外丝氨酸蛋白酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
引言寄生性线虫对畜牧业的生产发展可以产生巨大的影响。食线虫性真菌是线虫的自然天敌,它们能捕食活的线虫和寄生在虫卵里,把它们当作自己的营养来源,因此这种生物防控方法日益受到各国学者的广泛关注。少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)作为捕食线虫性真菌最具代表的一种模式真菌,被广泛地用于研究捕食线虫性真菌与宿主线虫的相互作用。Liang等(2013年)研究发现在少孢节丛孢菌
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胞外丝氨酸蛋白酶论文参考文献
[1].余涵,王永春,吴明德,张静,李国庆.生防菌盾壳霉胞外丝氨酸蛋白酶基因的克隆与功能研究[C].中国植物病理学会2016年学术年会论文集.2016
[2].赵海龙,孟庆玲,乔军,陈双庆,王国超.少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶P186基因的克隆、序列分析及表达[C].中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集.2014
[3].赵海龙,孟庆玲,乔军,陈双庆,王国超.少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶P186基因的克隆、序列分析及表达[J].华北农学报.2014
[4].王俊伟.少孢节丛孢菌侵染性胞外丝氨酸蛋白酶的基因克隆、表达及其杀线虫活性研究[D].石河子大学.2013
[5].张念章.副猪嗜血杆菌hhdA基因缺失株的构建及胞外丝氨酸蛋白酶免疫原性的研究[D].中国农业科学院.2011
[6].程古月.高温放线菌CDF芽胞表面蛋白酶及胞外丝氨酸蛋白酶的性质和功能研究[D].武汉大学.2010
[7].邹成钢,屠惠慧,张克勤.PacC基因调控粉红螺旋聚孢霉胞外丝氨酸蛋白酶基因PrC的表达[C].2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集.2008
[8].徐赤宇,温海,王溪涛,朱红梅,顾菊林.新生隐球菌的胞外蛋白水解酶及丝氨酸蛋白酶活性检测[J].第二军医大学学报.2006
[9].石鑫,杨晓野,杨莲茹.杀线虫真菌——少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶的研究进展[J].畜牧与饲料科学.2005