恩诺沙星时间分辨荧光免疫和纳米均相荧光免疫技术的建立与考核

论文摘要

人工合成的新型抗菌药物恩诺沙星（enrofloxacin）是第三代喹诺酮类药物（FQNs）之一,它通过抑制细菌DNA螺旋酶而抗菌,具有抗菌谱广、杀菌力强、体内分布广泛及与其它抗生素之间无交叉耐药性等特点,在预防和治疗畜禽的细菌性感染及支原体病方面取得良好的效果,现已广泛地应用于兽医临床。但由于致病菌产生耐药性和长期应用所产生的不良反应以及潜在的致癌性,其残留问题已引起广泛关注。许多国家和组织等都将其列入限制使用的兽药范围。本研究采用时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）,建立了恩诺沙星的高灵敏的检测方法。方法采用稀土离子Eu3+标记技术建立恩诺沙星时间分辨免疫检测法并对其进行方法学的考核,其检测的灵敏度可达5 ng/L,测量范围为0.01μg/L～100μg/L:向鳗鱼、猪肉、鸡肉样品中分别添加0.1μg/kg、10μg/kg、200μg/kg三个水平的恩诺沙星标准品,蜂蜜样品中添加0.34μg/kg、34.3μg/kg、342.8μg/kg,各样品的平均回收率分别为89.1℅、88.4℅、89. 0℅、89.4℅。方法的批内变异系数小于10 %,批间变异小于15 %。特异性实验表明恩诺沙星抗体与其他喹诺酮类药物交叉反应均较低,抗体的特异性很好。同时,初步建立了恩诺沙星纳米均相发光免疫检测法,并简要的对方法的稳定性、样品添加回收率等方面进行了考核。恩诺沙星纳米均相发光免疫检测法两步共30 min的反应模式大大缩短了检测时间,同时又保证了良好的精密度,批内、批间变异率均小于5 %;方法的灵敏度为2 ng/L,线性范围为0.007100μg/L。研究表明,恩诺沙星-时间分辨免疫检测法是目前已报道文献中检测恩诺沙星的最灵敏的方法,具有很好的应用前景。同时,本论文还对新兴的纳米均相技术进行了较全面的探讨,并初步建立了恩诺沙星纳米均相发光免疫检测法,为我国这一领域以及相关领域的研究提供了很有价值的参考资料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 恩诺沙星简介
• 1.1.1 恩诺沙星理化性质及作用
• 1.1.2 恩诺沙星的残留危害
• 1.2 恩诺沙星限量标准
• 1.3 恩诺沙星的检测方法及其局限
• 1.3.1 微生物法
• 1.3.2 理化检测法
• 1.3.3 免疫分析技术
• 1.4 时间分辨免疫荧光检测
• 1.4.1 时间分辨荧光免疫分析法
• 1.4.2 基本原理
• 1.4.3 时间分辨荧光免疫分析的标记
• 1.4.4 时间分辨荧光免疫分析仪
• 1.5 纳米均相荧光免疫检测
• 1.6 本课题的立题目的、意义和研究内容
• 1.6.1 目的和意义
• 1.6.2 研究内容
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.2 实验用溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 间接竞争恩诺沙星时间分辨免疫荧光法的建立
• 2.2.2 恩诺沙星时间分辨荧光免疫试剂盒的研制与考核
• 2.2.3 恩诺沙星纳米均相发光免疫检测法的建立方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 间接竞争恩诺沙星时间分辨免疫荧光法的建立
• 3+-羊抗兔抗体标记的鉴定'>3.1.1 Eu³⁺-羊抗兔抗体标记的鉴定
• 3.1.2 96 孔微孔板的选择
• 3.1.3 包被抗原工作浓度的选择
• 3.1.4 恩诺沙星多克隆抗体工作浓度的选择
• 3+-羊抗兔IgG 浓度的确定'>3.1.5 Eu³⁺-羊抗兔IgG 浓度的确定
• 3.1.6 反应动力学考察结果
• 3.1.7 恩诺沙星时间分辨免疫荧光法标准曲线的绘制
• 3.2 Enrofloxacin -TRFIA 试剂盒的研制与考核
• 3.2.1 灵敏度和工作范围
• 3.2.2 方法的回收率
• 3.2.3 方法的稳定性
• 3.2.4 精密度
• 3.2.5 方法的特异性
• 3.2.6 健全性考核
• 3.2.7 方法的相关性
• 3.3 恩诺沙星纳米均相发光免疫检测法的建立
• 3.3.1 恩诺沙星人工抗原-发光珠与恩诺沙星多克隆抗体工作浓度的选择
• 3.3.2 生物素化羊抗兔抗体稀释度的确定
• 3.3.3 不同温度下竞争反应时间的确定
• 3.3.4 缓冲液中BSA 浓度的确定
• 3.3.5 缓冲液中离子强度的确定
• 3.3.6 Enrofloxacin-LICLIA 标准曲线的绘制
• 3.3.7 添加回收试验
• 3.3.8 方法学比较
• 3.4 小结与讨论
• 3.4.1 小结
• 3.4.2 TRFIA 反应模式的选择
• 3.4.3 灵敏度的影响因素
• 3.4.4 标准曲线的数学模型和拟和方式
• 4 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 攻读硕士学位期间申请的专利