Twist调节乳腺癌细胞转移分子机制的初步研究

论文摘要

全世界每年约有120万妇女患乳腺癌,在西欧、北美等发达国家,乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。值得关注的是,我国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一,近年来乳腺癌发病率正以每年3%的速度递增,成为城市中死亡率增长最快的癌症。乳腺癌患者死亡的最根本原因不是原位瘤的生长而是由于肿瘤的转移,因此,乳腺癌转移机制的研究具有重要意义。Twist是一种bHLH（basic Helix-loop-Helix）类型的转录因子,近年来研究发现,Twist在乳腺癌中的表达显著升高,并能促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。为了探索Twist促进乳腺癌转移的分子机制,本实验采用RNA干扰技术建立了小鼠乳腺癌细胞4T1的Twist基因沉默细胞株。小鼠体内实验结果表明, Twist沉默能显著抑制4T1细胞的肺转移能力。在此基础上,利用寡核苷酸基因芯片技术检测了Twist沉默前后4T1细胞基因表达谱的差异性。基因芯片分析表明:Twist沉默前后表达差异显著的基因有167条,其中与肿瘤相关的基因有26条,包括15条上调基因和11条下调基因。这些基因可能在Twist引起的肿瘤转移过程中发挥重要作用。铁离子转运蛋白24p3是上述26条肿瘤相关基因之一,已有研究表明24p3在一些肿瘤中发生异常表达,在肿瘤的发生和发展过程中可能发挥重要作用。上述基因芯片结果显示Twist沉默能显著促进24p3的表达,这说明Twist有可能通过调控24p3的表达来影响乳腺癌细胞的转移。为了研究24p3在Twist介导的乳腺癌转移过程中的作用,我们在小鼠乳腺癌细胞株4T1中表达了24p3,建立了24p3过表达的乳腺癌细胞模型,并通过体外实验检测了24p3过表达对乳腺癌细胞生物学特性的影响。研究结果表明,24p3过表达对4T1细胞的增殖和克隆形成能力没有显著影响,但是显著增强了4T1细胞的迁移能力。进一步利用小鼠乳腺癌转移模型检测24p3对乳腺癌转移的影响。实验结果表明,与对照细胞相比,24p3过表达后小鼠原位瘤的重量没有明显差异,但肺转移结节数显著增多。这些结果说明在小鼠乳腺癌细胞中24p3的表达能促进其体内转移能力,提示24p3的表达程度很可能与乳腺癌的恶性程度密切相关。同时,Twist沉默后24p3表达量被上调,4T1的转移能力减弱;但是过表达24p3后没有抑制反而促进4T1细胞的转移。这些结果说明Twist可能并不是通过调节24p3的表达来影响乳腺癌的转移。综上所述,本文利用分子生物学和细胞生物学的方法,在分子、细胞和动物水平证明了Twist和24p3在小鼠乳腺癌转移过程中的作用。本研究结果不仅对于理解Twist调节乳腺癌转移的分子机制具有指导意义,而且将为乳腺癌的诊断及治疗提供了新的理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 1 转录因子Twist 的结构特点
• 2 Twist 的生物学功能
• 2.1 Twist在胚胎发育中的作用
• 2.2 Twist 与细胞周期及凋亡
• 2.3 Twist 与肿瘤侵袭转移
• 2.3.1 EMT 现象与肿瘤转移的关系
• 2.3.2 Twist与肿瘤发生发展的关系
• 3 Twist 有关的信号传导
• 4 24p3/NGAL基因特点和蛋白结构特点
• 5 24p3/NGAL功能的研究现状
• 5.1 24p3/NGAL 与先天免疫
• 5.2 24p3/NGAL 与细胞调亡
• 5.3 24p3/NGAL 与肿瘤发生发展
• 第一章 Twist 对小鼠乳腺癌细胞基因表达谱的调控研究
• 第一节 Twist 沉默细胞株的构建及Twist 沉默后对4T1 细胞体内转移能力的影响
• 1 实验材料和仪器
• 1.1 细胞株
• 1.2 菌种和载体
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 1.5 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 Twist 沉默细胞株的构建
• 2.1.1 感受态细胞的制备及质粒的转化
• 2.1.2 菌株的保存
• 2.1.3 采用碱裂解法提取质粒
• 2.1.4 细胞培养
• 2.1.5 细胞转染和阳性克隆筛选
• 2.1.6 细胞的冻存
• 2.2 定量PCR 检测Twist mRNA 的表达
• 2.2.1 Trizol 法提取细胞总RNA
• 2.2.2 反转录获得cDNA
• 2.2.3 实时定量PCR
• 2.3 小鼠乳腺癌转移实验
• 2.4 统计学处理
• 3 实验结果
• 3.1 Trizol 法提取细胞总RNA
• 3.2 实时定量 PCR 鉴定Twist mRNA 的表达
• 3.3 Twist 沉默能抑制乳腺癌细胞的肺转移
• 4 讨论
• 第二节 Twist 沉默后小鼠乳腺癌细胞中差异表达基因的分析
• 1 实验材料与仪器
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 芯片材料
• 2 实验方法
• 2.1 基因芯片实验和分析方法
• 2.1.1 总RNA 抽提（Trizol 法）
• 2.1.2 总RNA 的纯化
• 2.1.3 对样品RNA 进行荧光标记
• 2.1.4 杂交与清洗
• 2.1.5 芯片扫描
• 2.1.6 芯片图像的采集与数据分析
• 2.1.7 Ratio 分析
• 2.2 实时定量PCR 实验
• 2.2.1 总RNA 的抽提与反转录获得cDNA
• 2.2.2 进行Realtime PCR 反应
• 3 实验结果
• 3.1 基因芯片结果分析
• 3.2 芯片结果的验证
• 4 讨论
• 第二章 24p3 在乳腺癌转移过程中作用的研究
• 第一节 24p3 过表达细胞株的构建
• 1 实验材料和仪器
• 1.1 细胞株
• 1.2 菌种和载体
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 24p3 过表达载体的构建
• 2.1.1 用PCR 扩增获得小鼠24p3 的cDNA
• 2.1.2 PCR 产物的纯化回收
• 2.1.3 采用碱裂解法提取pMSCV-puro 质粒
• 2.1.4 双酶切pMSCV-puro 质粒和PCR 产物
• 2.1.5 载体和片段的回收
• 2.1.6 载体和片段的连接
• 2.1.7 感受态的制备与转化
• 2.1.8 酶切鉴定阳性克隆
• 2.1.9 阳性克隆的菌株保存及测序
• 2.2 24p3 过表达细胞株的构建
• 2.2.1 细胞培养及传代
• 2.2.2 细胞转染和阳性克隆筛选
• 2.3 半定量PCR 检测24p3 mRNA 的表达
• 2.3.1 Trizol 法提取细胞总RNA 及反转录获得cDNA
• 2.3.2 半定量RT-PCR
• 2.4 免疫沉淀及免疫印记实验
• 2.4.1 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）
• 2.4.2 免疫印记实验（Western blotting，WB）
• 3 实验结果
• 3.1 24p3 过表达载体的构建
• 3.1.1 PCR 扩增克隆得到24p3 基因
• 3.1.2 过表达载体的酶切鉴定
• 3.2 24p3 过表达后24p3 mRNA 表达水平的变化
• 3.2.1 细胞总RNA 的提取
• 3.2.2 24P3 过表达后mRNA 表达水平的变化
• 3.3 24p3 过表达后蛋白表达水平的变化
• 4 讨论
• 第二节 24p3 的过表达对小鼠乳腺癌发生发展的作用
• 1 实验材料和仪器
• 1.1 细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 细胞复苏
• 2.2 MTT 法检测细胞增殖活性
• 2.3 Transwell 小室法测定细胞迁移能力
• 2.4 克隆形成实验
• 2.5 体内肿瘤形成和转移实验
• 2.6 统计学处理
• 3 实验结果
• 3.1 24P3 过表达对4T1 细胞增殖能力的影响
• 3.2 24P3 过表达对4T1 细胞克隆形成能力的影响
• 3.3 24P3 过表达对4T1 细胞体外迁移能力的影响
• 3.4 24P3 过表达对小鼠乳腺癌细胞肺转移能力的影响
• 4 讨论
• 总结和展望
• 参考文献
• 硕士期间发表的文章
• 致谢