N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶的克隆表达及其应用

论文摘要

N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶（AGE）是酶法合成N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）的关键酶。在已确立的双酶法制备Neu5Ac方法中,大肠杆菌来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶（NAL）已经商品化;而来源于猪肾的AGE基因（age）在大肠杆菌中表达时,由于物种间差异,大部分形成包涵体,酶产量很低。因此,寻找高表达、高活性的AGE显得非常必要。本论文就是以此为对象,进行了以下研究:首先,对猪肾和鱼腥藻来源的AGE基因（age）进行了克隆和表达。通过RT-PCR、PCR方法,从两个物种中分别得到与已知基因序列完全一致的age基因。将两个基因分别克隆到表达载体pET30a上,构建成表达质粒pLY9和pLY11,并转入E.coli BL21（DE3）中进行了表达。其次,建立了HPLC柱前衍生化产物检测AGE酶活的方法。根据此方法的检测,在相同的培养诱导条件下,来源于鱼腥藻的AGE表达产量是猪肾来源的16倍。考察了鱼腥藻来源AGE的性质,结果显示该酶在pH8.0,温度40℃条件下活性最强。最后,利用表达的鱼腥藻源AGE与大肠杆菌源NAL,对双酶法制备Neu5Ac进行了研究。设计和研究了三种制备方式:（1）以pET30a为基础构建NAL和AGE双基因共表达基因工程菌,该基因工程菌可以同时产生NAL和AGE。实验证明,利用该方法制备的粗酶液具有NAL和AGE活性,并且可用来制备Neu5Ac。（2）利用分别诱导表达的E.coli BL21（DE3）/pLY3和E.coli BL21（DE3）/pLY11菌体进行双酶转化实验,结果转化产物Neu5Ac产量很低。（3）将分别诱导表达的工程菌破碎制备NAL和AGE粗酶液进行双酶转化实验,结果获得转化产物Neu5Ac。对该方法进行了转化条件优化,在考察了底物浓度,酶的比例、温度、反应pH、反应时间等因素后,获得的最佳转化条件为:丙酮酸钠250 mmol;N-乙酰-D-葡萄糖胺550mmol;NAL 1.28 U/ml;AGE 0.48 U/ml;pH 8.0;温度25℃;转化12 h。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第1章 绪论
• 1.研究背景
• 1.1.唾液酸的发现
• 1.2.唾液酸的性质及检测
• 1.3.自然界中存在的唾液酸
• 1.4.唾液酸的生物学功能
• 1.5.唾液酸与疾病
• 1.6.唾液酸的制备方法
• 1.7.NAL和AGE概况
• 2.立题依据
• 第2章 N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的克隆
• 1.材料
• 1.1.试剂
• 1.2.菌种和质粒
• 1.3.培养基
• 1.4.缓冲液与溶液
• 1.5.主要实验仪器
• 2.方法
• 2.1.菌种的培养和保藏
• 2.2.碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA
• 2.3.大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.大肠杆菌质粒转化
• 2.5.DNA片段凝胶回收（V-gene DNA Gel Extraction Kit）
• 2.6.质粒DNA的酶切
• 2.7.质粒与外源片段的连接
• 2.8.PCR扩增
• 2.9.RT-PCR反应
• 2.10.猪肾总RNA的提取
• 2.11.微量制备鱼腥藻染色体
• 2.12.两种N-乙酰D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因亚克隆的构建
• 3.结果与讨论
• 3.1.猪肾总RNA的抽提
• 3.2.猪肾N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的克隆
• 3.3.微量制备鱼腥藻染色体
• 3.4.鱼腥藻N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的克隆
• 4.结论
• 第3章 N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的表达
• 1.材料
• 1.1.试剂
• 1.2.培养基
• 1.3.蛋白纯化亲和树脂
• 1.4.缓冲液与溶液
• 1.5.主要仪器设备
• 1.6.菌种和质粒
• 2.方法
• 2.1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.菌体破碎
• 2.3.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶的纯化
• 2.4.蛋白含量的测定（Bradford法）
• 2.5.猪肾N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因表达质粒的构建及诱导表达
• 2.6.鱼腥藻N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因表达质粒的构建及诱导表达
• 2.7.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶活性测定
• 3.结果与讨论
• 3.1.猪肾N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因表达质粒的构建及诱导表达
• 3.2.鱼腥藻N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因表达质粒的构建及诱导表达
• 3.3.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶活性测定
• 3.4.猪肾AGE与鱼腥藻AGE表达产量比较
• 4.结论
• 第4章 双酶法制备N-乙酰神经氨酸的研究
• 1.材料
• 1.1.试剂
• 1.2.培养基
• 1.3.菌种与质粒
• 2.方法
• 2.1.Neu5Ac的HPLC检测
• 2.2.NAL酶活测定
• 2.3.AGE酶活测定
• 2.4.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.5.产酶基因工程菌的诱导表达
• 2.6.粗酶液制备
• 2.7.NAL与AGE共表达基因工程菌的构建及制备Neu5Ac实验
• 2.8.单独表达AGE和NAL制备Neu5Ac
• 2.9.全细胞转化制备Neu5Ac
• 3.结果与讨论
• 3.1.NAL与AGE共表达基因工程菌的构建及Neu5Ac的制备
• 3.2.单独表达AGE和NAL制备Neu5Ac
• 3.3.全细胞转化
• 4.结论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录1 猪AGE酶基因测序结果
• 附录2 鱼腥藻AGE基因测序结果
• 附录3 N-乙酰神经氨酸质谱检测图
• 附录4 N-乙酰-D-葡萄糖氨质谱检测
• 附录5 双酶转化混合物质谱检测图
• 致谢