籼稻高效遗传转化体系的建立

论文摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物之一,世界上约40%人口的主要食粮是水稻,同时水稻也是单子叶植物基因组学遗传和功能组学研究的模式植物,在我国地位仅次于小麦。近年来,遗传转化在水稻品种改良、基因功能检测、创造突变体中发挥着越来越重要的作用,随着分子生物学研究的深入,基因的分离、克隆和重组技术以及转基因的日趋成熟,遗传转化己成为水稻遗传改良的一种有效手段。水稻的遗传转化中最常用的是农杆菌介导法和基因枪法。农杆菌转化系统是模仿天然的载体转化系统,和其它转化方法相比,农杆菌介导法具有其独特的优势,而使其广泛应用于水稻研究中。然而,水稻品种间遗传差异性很大且对转化反应的基因依赖性强,从而增大了遗传转化的复杂性和随机性。尤其是对于籼稻品种,仍存在着较大的困难,虽然国内外报到了一些籼稻转化成功的例子,但是转化率却非常低,而且仅限于特定的品种,还未能找到适合于所有籼稻品种转化的通用转化平台。因此,要建立高效稳定的籼稻遗传转化体系仍有许多问题需要研究,而且在绝大多数南方地区栽培品种主要为籼稻,因此,遗传转化技术对籼稻进行改良具有重大的现实意义。本研究主要进行了如下工作:1、分析了影响农杆菌转化水稻的主要因素,结果发现:菌液浓度OD值为0.3-0.5之间最有利于感染,并且在感染时附加振荡,效果更佳;在菌液和培养基中都不添加AS,反而提高了转化率;加入维生素C对防止愈伤褐化有很好的作用;对洗菌后的愈伤进行充分干燥、改变培养基中的碳源、提高分化培养基中琼脂的浓度等等方法,从而得出一套改良后的转化体系。2、对所获得的抗性愈伤转和转基因植株分别随机进行抽样检测,发现在转基因植株中和抗性愈伤中:抗hpt的概率分别在85%和90%左右;抗gus的概率分别在92%和96%左右。3将优化后的体系与原有的体系相比较,我们发现转化率由原来14.4%提高到26.4%。然后将含有同一种质粒的三种不同农杆菌AGL1,EHA105和LBA4404分别用改良前和改良后的转化体系转化,结果发现,EHA105的转化率最高,达到了25%,其次是LBA4404。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 水稻遗传转化方法评述
• 1.1.1 直接转化方法
• 1.1.2 农杆菌介导法
• 1.2 农杆菌及其介导水稻遗传转化的原理
• 1.3 农杆菌介导水稻遗传转化研究的回顾
• 1.3.1 农杆菌的摸索阶段
• 1.3.2 农杆菌的技术突破和成熟阶段
• 1.4 影响农杆菌介导水稻遗传转化效率的因素
• 1.4.1 转基因受体的影响
• 1.4.2 水稻基因型
• 1.4.3 农杆菌菌株和质粒载体
• 1.4.4 vir 基因的诱导
• 1.4.5 农杆菌侵染方式农杆菌菌液浓度
• 1.4.6 共培养条件
• 1.4.7 筛选标记基因以及筛选剂的选择
• 1.5 遗传转化方法在水稻遗传改良上的应用
• 1.5.1 抗病性改良
• 1.5.2 抗虫性改良
• 1.5.3 抗逆性改良
• 1.5.4 品质性状的改良
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.6.1 本研究的目的
• 1.6.2 本研究的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试水稻品种
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.2 实验仪器和药品
• 2.2.1 主要药品
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 农杆菌介导的水稻转化全过程[115]
• 2.3.2 水稻转化频率的计算
• 2.3.3 水稻叶片DNA 提取
• 2.3.4 小量提取质粒DNA（碱裂解法）
• 2.3.5 转基因植株的分子检测
• 2.3.6 农杆菌感受态细胞的制备及电激法转化
• 2.4 试验设计
• 2.4.1 水稻转化受体的选择
• 2.4.2 农杆菌对水稻愈伤组织转化的试验设计
• 2.4.3 组织培养褐变处理
• 2.4.4 转化子的筛选和植株再生
• 第三章 结果与分析
• 3.1 转化前实验结果
• 3.1.1 外植体对水稻转化频率的影响
• 3.1.2 愈伤组织继代次数对转化频率的影响
• 3.2 转化过程中的实验结果
• 3.2.1 农杆菌培养方式改变对对水稻转化率的影响
• 3.2.2 菌液浓度对转化效率的影响
• 3.2.3 农杆菌侵染方式对水稻转化率的影响
• 3.2.4 是否添加AS 对转化效率的影响
• 3.2.5 共培养基pH 值对转化效率的影响
• 3.3 转化后的实验结果
• 3.3.1 抗氧化剂对水稻愈伤组织转化率的影响
• 3.3.2 干燥处理对抗性愈伤组织获得的影响
• 3.3.3 不同筛选方式对农杆菌介导水稻转化效率的影响
• 3.3.4 不同的碳源对水稻转化率的影响
• 3.3.5 抗性愈伤筛选时间对分化的影响
• 3.4 优化后的农杆菌转化体系
• 3.4.1 优化后的明恢86 体系
• 3.4.2 新旧农杆菌介导转化体系对比
• 3.4.3 转基因植株的分子生物学检测
• 3.4.5 电激法将质粒pGUSAJ4 导入三种农杆菌中
• 3.4.6 三种农杆菌株对水稻愈伤组织转化频率的比较
• 第四章 讨论
• 4.1 农杆菌菌株和载体对转化频率的的影响
• 4.2 转化受体类型及生理状态对转化频率的的影响
• 4.3 愈伤组织继代次数对转化率的影响
• 4.4 共培养时几个因素对转化效率的影响
• 4.4.1 酚类化合物
• 4.4.2 农杆菌菌液浓度
• 4.4.3 侵染方式
• 4.4.4 共培养温度
• 4.4.5 共培养PH
• 4.5 关于组织培养过程中的褐化问题
• 4.6 碳源对水稻转化的影响
• 第五章 结论
• 参考文献
• 图版1：农杆菌介导转化水稻胚性愈伤获得完整植株
• 附录1：农杆菌介导的转化所用基本培养基配方
• 附录2：实验结果数据
• 致谢